综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展(2)

和层析[77]；或者通过加入无水乙醇、异丙醇来达到浓缩质粒DNA的目的，但无论是前者还是后者都存在着不足，过柱的速度通常较慢，且质粒DNA的电荷性和疏水性与杂质RNA、内毒素、宿主蛋白都很相似，不易掌握具体的pH和盐浓度；醇类的浓缩需要的体积很大，无疑增加了成本，而且有背于不能使用易燃、易爆物品的原则。因此，其他的浓缩方法应运而生，这包括分子切向流法[80],小分子类物质如精胺[79]、十六烷基三甲基溴化铵[80]、聚电解质[81]等，另外芳香化合物[82]和MnCL2[83]等都有报道。 4.4 宿主细胞中核酸和其他内容物的组成

正常生理状况下，大肠杆菌宿主细胞含有水、核酸、蛋白质、内毒素和小分子和一些离子，其占有含量和种类各不相同，分子量也差异很大，如Atkinson[84]所述，见表。 种类 总量（％W/W） 种类/个细胞 平均分子量 水 70 1 18 核酸

基因组 0.5 1a 2.8×106 转移RNA 4.8 40 28

核糖体RNA 0.9 3 500-1000 信使RNA 0.3 400-800 660-990 质粒DNA <1 1 3300b 蛋白质 15 1100 8-200 内毒素 5 10

小分子和离子 3 800-200 <1

a．快速生长的大肠杆菌细胞中含有4个基因组分子。 b．质粒分子大小为5kb。 4.4.1 RNA

粗制的质粒DNA中，RNA的含量是质粒DNA含量的20倍左右[78]，因此，如何有效地消除RNA尤其是大分子量的核糖RNA和信使RNA十分重要。现今，绝大多数的纯化方法都使用了牛源性的RNase A，这有违于禁止使用动物源性酶制剂的相关条例[85]。2001年，Cooke[86]有使用表达RNase A基因的宿主菌来制备质粒DNA的成功报道，本实验室也有使用大肠杆菌分泌表达的重组牛RNase A来消除RNase A的成功经验（未发表）。David[87] 的试验结果表明在碱性条件下长时间孵育也可以很好地消除RNA，但是根据我们的试验数据，超螺旋质粒DNA的比列严重下降，损害了质粒DNA的质量。此外，37℃利用内源性RNase A也可去除40％的RNA[88]，2M的氯化钙[89]、5M氯化锂[5]等都可成功消除RNA。 4.4.2 蛋白质

粗制质粒中杂蛋白的含量也相当可观，一定数量的杂蛋白除了降低质粒DNA的转染效率外，可引起机体的异源免疫反应，它的去除一直依赖于对人体和环境有污染和腐蚀的苯酚、氯仿。考虑到蛋白的分子量远远比质粒DNA小，Teeters认为可以利用分子量上的巨大差异来去除蛋白质[92]。Russel J [80]和 Wahlund[81]报道利用CTAB或聚电解质与DNA双螺旋大小沟特异结合的特性可以选择性沉淀DNA，而将杂蛋白留在上清中，通过离心就达到去除蛋白的目的。另外，用离子交换层析[91]和亲和层析柱[92]等技术都可以除去蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的，并取得了很好的纯化效果。 4.4.3 内毒素

细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜上的特有结构，在细菌生长、死亡的过程中被释放出来，在质粒制备过程当中，细胞破碎后，大量的内毒素都释放到溶液中[93]。由于内毒素具有极强的热源性，少量的LPS就可以引起发烧、血液循环障碍甚至休克死亡，因此它的去除显得十分地重要[94]。由于内毒素常常形成囊状结构，其分子量与质粒大小相似，而且电荷性与

疏水性都与质粒DNA相似，给质粒DNA的纯化带来了很大的麻烦。目前，内毒素的去除方法主要分为三大类：一是非选择性去除，包括活性炭吸附和萃取[95]，利用分子量差异进行的超滤[96]和pH值差异进行的离子交换色谱[97]，这几种方法没有考虑到LPS结构方面的特殊性质，去除效率较低；二是选择性去除，主要是指亲和色谱法，找出适当的配基，将其固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，即可成为一种高效能、高选择性的LPS吸附剂，这些包括组胺、组胺酸类[98]；多粘菌素B[99]；聚阳离子配基如PEI[100]，聚-L-赖氨酸[101]；荷正电聚合物γ-甲基-L-谷氨酸酯[102]等；三是特异性去除法，这是根据LPS结合蛋白（LBP）的结构和功能，提出的一种内毒素去除的特异性配体。 4.4.4 基因组DNA

符合药物动力学质粒中的宿主基因组DNA的含量必须小于10ng/μg质粒DNA，在发酵至纯化的过程中，由于酶解和机械剪切力的作用，宿主基因组非常易断，而现行的离子交换等各层析法纯化质粒DNA包括了其不能有效去除宿主基因组DNA和内毒素的缺点，在消除基因组DNA的试验中，以Levy[103] 和 Winters[104]的硝酸纤维膜和硅酸钙最为有效。 4.5 质粒纯化策略

氯化铯密度梯度超速离心是质粒纯化的标准分子生物学方法，但此方法耗时，而且难以扩大，并使用了有毒和诱变试剂，不适合用于临床的质粒DNA的生产。虽然目前纯化质粒DNA的技术还很不成熟，但一些方法具有很大的吸引力。从目的上来讲，实验室制备小量的质粒可能更多的从纯度上考虑，但是要大规模生产质粒，除了纯度上的问题，还有过程的可放大性，重现性，成本等诸多问题需解决。 4.5.1 离子交换色谱

离子交换色谱（Ion exchange chromatography, IEC）利用离子交换剂为固定

相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗 脱层析法。鉴于核酸溶液带有多聚阴离子，可以采用阴离子交换色谱的方法纯化

质粒 DNA[105]。DNA 的双螺旋结构使亲水性和疏水性基团分离，疏水性碱基处于双螺旋的内部，两条螺旋形糖-磷酸链缠绕在双螺旋结构的外侧，从而形成多阴离子、高度水化的亲水表面，Stahlberg 等人[106]提出一种量化理论，假定带有多电荷的生物分子和离子交换剂表面间的相互作用，可以看作是两个带电荷表面在与缓冲盐溶液接触时的远距离静电作用，固定相表面是带电荷的基团，使其表面和溶液之间产生了静电势差，从而具有吸引那些带有相反电荷的溶质分子来到表面的能力。 4.5.2 分子排阻色谱 分子排阻色谱，又被称为凝胶过滤，可以用来分离不同大小及具有不同流体力学半径的分子。与阴离子交换树脂不同，用作分子排阻色谱的树脂不和质粒或 者其它杂质结合，该树脂包含有具有确定大小的通道。较小的分子比较大的分子更容易进入这些孔中，并且由此在柱中的流动受到阻碍。既然不用以高浓度的盐或者有机试剂来洗脱质粒，分子排阻色谱的操作显得相对较为简单。洗脱顺序与分子大小顺序相反，最大的分子最先洗出。分子排阻色谱在将质粒DNA从小的RNA片段及被RNA 酶消化的核酸中分离出来显得特别有效，它也能被用于移除质粒溶液中的盐、缓冲液和其它低分子量的化学试剂。分子排阻色谱也可能将质粒从比它更大的 gDNA 分子中分离出来，而且，分子排阻色谱在移除内毒素方面显得很有成效。但分子排阻色谱有相对较低的分辨率，一般要将两种分子达到完全的分离需要这两种分子大小相差至少两倍。因此，在分子大小上与质粒 DNA 相近的染色体 DNA 以及高分子量的 RNA 片段就很难由分子排阻色谱除掉。该基质的排阻极限对蛋白质是 100×106 Da，对线性DNA是20kb，对球状微粒是 400nm。70％的回收率中洗下部分几乎是纯的超螺旋质粒 DNA[107]。 4.5.3 疏水色谱

大肠杆菌gDNA本身是双链DNA，但经碱裂解之后，绝大多数变成了单链，两条链相互分离并部分断裂，因此疏水碱基暴露，在疏水色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）过程中，质粒分子的疏水碱基隐藏在双螺旋内部，与配基的作用力非常微弱，另一方面，高浓度的单链核酸，如RNA和变性的gDNA则与配基牢固结合，同样道理，变性的质粒DNA也暴露了疏水碱基，可以通过HIC去除，LPS通过脂基团而与HIC的配体发生作用，而且只有在降低盐离子浓度后方可被洗脱，合成的寡核苷酸进行的试验表明，单链越长，与HIC柱子吸附的时间越长，说明了核酸分子中碱基多少与吸附时间成正相关。Diogo[108]报道通过此方法可以降低内毒素的含量20倍以上，天津大学的Yuan Li[109]等人报道使用HIC来纯化质粒pcDNA3.0也获得了良好的效果。 4.5.4 亲和色谱

亲和层析基于连接在固相支持物上的寡聚核苷和引入目标质粒的特定序列之间形成的三重螺旋结构发展起来[110]。显然，这些支持物对超螺旋构型的质粒的亲和力比对松弛异构体的亲和力高。回收率可高达62％，同时将RNA和gDNA 的含量降低到检测不出的水平。另外，乳糖阻遏蛋白等也能与特殊DNA序列结合的物质小规模纯化质粒。不管是寡聚核苷和质粒结合还是特殊的蛋白和质粒结合，亲和配体和固定相偶联，并同质粒的目标序列相互作用。因为这种结合是依据特定序列的，所以亲和色谱能够高效地将质粒DNA从蛋白质，RNA 和非特定DNA中分离出来。然而，这些方法也只限于小规模的质粒纯化。这主要是因为构建大量的亲和树脂在技术上有困难，同时成本很大。此外， Woodgate[111] 和 Kostal[112] 分别研究了使用锌指结构的GST的序列特异性的层析和以温度诱导金属调节蛋白MerR进行质粒纯化的策略，这两项研究可以丛细胞裂解液中直接纯化质粒DNA，规模可以放大，特异性好，成本也较低，为今后的质粒纯化提供了一定的借鉴。 4.5.5 芳香层析

2003和2004年，Lemmens和Lena M[82，113]先后报道了在高浓度离液剂或水化盐的情况下，使用芳香硫醚为配基的亲硫层析进行了高质量的质粒纯化，其机制可能是包括质粒DNA在内的各种核酸分子在高浓度水化盐如硫酸铵的存在下，各分子发生不同程度的浓缩和结构的改变，而恰恰是这种结构的改变促使超螺旋质粒DNA可以通过π-π作用与配基上的芳香基团结合而被纯化。 4.5.6 去污剂

CTAB 是一种阳离子表面活性剂，它可以与DNA 分子上带有负电荷的磷酸基团发生强烈的静电相互作用，同时，其碳链也可以和 DNA 分子发生疏水互作用，从而中和带电的 DNA 分子使它们从溶液中沉淀下来。向细胞裂解液缓慢地加入CTAB，一方面，可以选择性地沉淀质粒DNA；另一方面，蛋白质、RNA和脂多糖等杂质保持完全溶解的状态。质粒沉淀后，可以往沉淀中加入浓的氯化钠溶液来去除 CTAB。质粒沉淀物中还含有少量 gDNA，但是如果加入的氯化钠的量控制得很精确，就可以只溶解质粒 DNA，而 gDNA 仍然保持沉淀状态。在使用 CTAB 沉淀纯化质粒 DNA 后，质粒的纯度达到 90％，再用盐溶液溶解之后，质粒纯度达到 99％[80]。使用这种方法大规模纯化质粒的关键在于 CTAB 及 NaCl 的加入应该做到精确控制。因此，在线实时检测系统显得必不可少。 2005年，***学者Chowdhury报道使用两性去污剂十二烷基二甲酯氨硫璜丙烷和碱来纯化高质量的质粒DNA[114]，其作用原理可能是去污剂使蛋白分子等杂质随机组装从而形成可见的“软”沉淀，而质粒DNA则通过静电作用被包裹并与杂质形成分离，并由于两性去污剂独特的作用溶解在可溶相中。 4.5.7 浓缩沉淀剂

常规的质粒DNA纯化方法耗时长、使用了吸附剂、核酶和过滤介质等，限制了质粒DNA的规模化提取。1999年，Jamie[115]报道了使用浓缩沉淀剂来选择沉淀质粒DNA的原理，

该类沉淀剂是小的阳离子分子，可以与双链DNA的大沟和小沟相结合，缩小DNA体积4-6倍，同时还起到包裹DNA的作用，在其浓缩沉淀质粒DNA的过程中，一般都在低的盐离子下进行。当其与大、小沟上的磷酸基团相互作用，周围的DNA分子都发生浓缩时即可发生沉淀，而且，这些分子不但减少了双螺旋之间的排斥作用，还使其相互连接。

这种应用最早是Hoopes和McClure[116]在用精胺和亚精胺从小分子中沉淀大分子DNA的试验中被证实，最初鲑精DNA，Pbgs19Luxwt（6.0kb）均在低离子浓度下被沉淀，而在600mM的NaCl中未出现沉淀。Mourich[79]于2004年也有用精胺纯化pTH.HM的报道，并比较了其与QIAGEN公司无内毒素试剂盒纯化质粒的转染效率，成本为3.16美元/毫克质粒。 Bloomfield和Shenoy报道的MnCl2[83]与精胺一样，同样可以通过与DNA大小沟结合来分离和纯化质粒DNA。 4.5.8 磁性分离法 2005年，中国台湾的Chen-Li Chiang[117-118]连续报道了使用化学方法制备微小颗粒Fe3O4，并用多聚阳离子聚乙烯亚胺（PEI）包裹，将其置于磁场下，通过顺磁性可以从细菌裂解液中直接纯化质粒DNA，这种磁性颗粒在磁场下，具有磁性强和低毒性的特点，在生物领域备受关注，严格来讲，只有在磁场中，它们才呈现磁性，而且这个特性使得其可重新分散和重复利用。金属可以鳌合氨基酸从而来纯化蛋白，现发现，金属同样可以鳌合暴露出的嘌呤碱基而与单链核酸结合而与质粒DNA分离，Balan[119]等研究证实，用铜载的多聚N－异丙基聚丙酰烯胺和乙烯基咪唑，可以从宿主菌裂解液中特异吸附RNA分子，从而达到纯化质粒DNA的目的，先前质粒DNA的纯化大都依靠吸附、密度或结构差异从基因组DNA、RNA和蛋白质中分离质粒，用金属来分离纯化核酸的报道非常少见，鳌合配基如次氮基三乙酸和亚胺酸与二价金属离子偶联，通过π-d的轨道重叠，与芳香氮具有高亲和力，从而达到纯化效果。

4.5.9 双水相分离质粒DNA

1962年，Albertson[120]是最早利用双相分离法生物分子的研究工作者之一，但是该技术在质粒DNA纯化上的进展缓慢，1978和1991年才由Ohlsson[121]和Cole[122]报道了两个研究报道。直至2002年，Ribeiro[123]系统描述了用PEG/磷酸盐的两相法纯化质粒DNA的报道，并证明用PEG600和PEG1000与磷酸盐组成的两相分离体系的回收率高，杂质少，具有喜人的前景，随后两年，Trindade[124] 和Kepka[125]也分别有用两相分离法纯化质粒DNA的报道。

4.5.10 分子切向流

Tangential flow filtration(TFF)技术主要利用质粒DNA、RNA、基因组DNA等分子的大小不同，滤掉RNA和蛋白质等小分子，而将质粒DNA保留在膜上，使用TFF的主要注意事项是跨膜压、膜孔和缓冲液的传导性。Eon-Duval[78]使用TFF技术成功地纯化了含有乙肝表面抗原基因的质粒（7.7kb），David使用TFF技术纯化了6种质粒DNA，RNA的去除率达99％以上，蛋白质的消除也大于95％。

除了以上列举的方法之外，还有许多改进的纯化策略，如使用膜[126](membrane)和盘[127]（monolith）制作的色谱技术，一改以往柱吸附效率低下，不适合规模化生产的缺点。 五、质量控制及检定的要求

基于质粒 DNA 的生物药剂是高度化学限定的，因此能用化学，生化和物理试剂对其进行分析。为确保产品符合规格而分析所制备的质粒的安全性、效力及纯度是使整个生产流程得以建立的关键问题。评价用作基因治疗和 DNA 疫苗的 DNA 产品的纯度，安全性及效力的主要标准和推荐试剂如下所示：

5.1 产过程中质量监控标准的建立及要求

在生产工艺的各个环节和步骤中对其产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行。

由于各种方法的工艺不同，所制定的监控标准和在何步骤进行监控可能不同，但其原则是保证产品的质量、工艺的连续性和稳定性。 5.2 产品的质量检定与要求

外观检查：根据样品的特征建立外观的质量标准，高纯度的质粒DNA呈现生鱼肉透明状，pH一般为7．2±0．5。

纯度：主要是评价纯化的重组DNA制品中是否含有宿主RNA、DNA、内毒素和蛋白的污染。一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测制品中有无RNA，要求无明显的RNA带型；采用Northernblot或荧光定量PCR的方法检测制品中残留的宿主DNA的含量，在该方法的研究时应建立宿主DNA的标准品，并对该类试剂的敏感性和特异性进行验证。要求DNA制品中残余的宿主DNA含量不超过0.01μg/μg 质粒。可以二辛可宁酸法检测制品中宿主蛋白的残余量，在该方法的研究过程中应建立宿主蛋白的定量标准，并对检测方法的敏感性和特异性进行验证，其性能能满足该实验的要求，宿主蛋白的含量应不超过0.001μg/μg质粒DNA。 可以检测样品在波长为260nm和280nm的紫外吸收值，并计算A260/A280的比值，评价制品的总体纯度，要求其比值在1.75-1.85之间。 质粒大小的均一性和结构的分析：主要是分析超螺旋结构与线性和松弛性质粒的比例，一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法对制品进行电泳分析，并用扫描仪对电泳结果进行扫描，分析各带型所占的比例，一般要求环状结构的重组质粒所占的比例在90%以上。 鉴别实验：主要是对重组质粒的特征以及是否含有正确的插入片段进行分析。至少用三对以上限制性内切酶对重组质粒进行酶切，对酶切产物分别进行电泳分析，观察是否有特征性的带型；用PCR方法对插入片段进行扩增或用特征性的酶切方法分析插入的基因片段的大小是否与预计的大小一致。

体外效力实验：体外转染哺乳动物细胞，检测其表达量，需建立定量检测表达抗原的方法以及表达抗原的定量标准，还应检测表达抗原的图谱，其各表达目的抗原的大小应与预计大小相同，应建立相应的方法并进行验证。制定各表达抗原的量和图谱的质量控制标准。 无菌实验：应检测需氧菌、厌氧菌以及支原体等，制品中应无该类微生物的污染。

热原实验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，要求内毒素的含量不高于0．1EU/ug；也可以用其它方法如家兔试验检测制品的热源。

抗生素及其它添加物质残余量的检测，由于DNA载体一般使用抗菌素的选择性标记，重组DNA的研制和制备过程中采用含抗菌素的选择性培养基进行培养，在纯化制品中对抗菌素的含量应进行限制，因此，应建立检测抗菌素的检测方法并制定抗生素残留量的要求。 在重组DNA的培养和纯化工艺中，可能需要一些其它物质或基质，如纯化工艺中可能需要乙醇，这些物质可能对人体有潜在的危害，应在纯化制品中限制其含量，因此，应建立检测方法并制定残留量的标准。 安全性实验：该实验是控制该类制品质量的重要指标，由于该制品与一般生物制品相比又有其特殊性，因此，在安全性方面除了考虑一般的安全性实验，还应考虑该制品的特异性安全性。

稳定性实验：由于DNA超螺旋结构的不稳定性，而且超螺旋结构的比例多少可能影响重组DNA的转染率，因此，在该类制品的稳定性实验中应主要考虑超螺旋结构的稳定性。应建立检测超螺旋质粒稳定性实验方法，并建立相应的质量标准。

生物效价：由于用于预防的DNA制剂所发生作用的原理不同，评价其生物效价的方法也不同。如果DNA制剂是通过免疫反应发生作用的，则应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，可以计算小鼠ED50以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的质进行评价；在评价细胞免疫效价时，应当建立检测

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