WB操作步骤

操作步骤

（一） 蛋白样品制备

（1）贴壁细胞总蛋白的提取：（整个操作尽量在冰上进行）收集细胞，加裂解液100ul漩涡混匀，冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 （二） 蛋白含量的测定 （1） 制作标准曲线

1、 从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2、 取适量的蛋白标准稀释至终浓度0.5 mg/ml ；

按照下表将0.5mg/ml BSA和稀释液PBS加到96孔板中，并取样品2ul加入96孔板中，加PBS至20ul.（样品和标准品均设置复孔）

3、 按A:B=50:1配制适量的BCA工作液，混匀，室温24h内稳定。

各孔加入200ulBCA工作液37°30min后，测定A562，求平均值，绘制标准曲线。

编号 1 0.5mg/ml BSA (ul) PBS(ul) 2 1 19 3 2 18 4 4 16 0.1 5 8 12 0.2 6 12 8 0.3 7 16 4 0.4 8 20 0 0.5 0 20 得到标准BSA浓度 (ug\%ul) 0 0.025 0.05 （三） SDS－PAGE电泳

电泳时间一般为2～3h，电压为80V 30min;120V 3h较好，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。 SDS-PAGE 分离胶浓度 6% 8% 10% 最佳分离范围 50-150kD 30-90kD 20-80kD

12% 15% 12-60kD 10-40kD ? 配制10%的过硫酸铵 ? 配制12%分离胶（5ml)

? 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水 ? 聚合40分钟后，倒掉蒸馏水 ? 配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶 ? 插上梳子，聚合20分钟

?

注意：灌胶过程中避免产生气泡

（四）转膜

转膜详细操作过程：

（1）转一张膜需准备6张7.0～8.0cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜。切滤纸和膜

时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF膜则在M-OH中浸泡10min以上后转入TBS液中平衡。将滤纸浸入TBS液中润湿。

（2）在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。轻轻划开分离胶与玻板左右两边的接触面，不然取胶时容易弄破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡（膜盖下后不可再移动）。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。注意膜在正极+侧，分离胶在负极-侧。标记正反面。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）

（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。湿转一般用400mA转移1:30 h，根据分子量大小调整。

转移方法的选择：

? 半干转

? ? ? ?

用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法； 适合转移小分子量的蛋白；

半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的； 1.2-2MA/CM2 1h

? 湿转

?

将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法；

? ? ?

适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h

（五）免疫反应 （1）封闭：

转完后将膜用去离子水或TBST从下向上浸湿后吸干，将膜在含5%脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)的平皿中，室温下封闭1h。 （2）一抗孵育：

将一抗用一抗稀释液或TBST稀释至适当浓度（在15ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。(本实验室用封膜机将膜蛋白密封) （3）二抗孵育：

同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。 （六）化学发光，显影，定影

（1）将A和B两种试剂在EP管中等体积混合；1min后，将此混合液充分涂抹在膜蛋白面上；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。 （七） 凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

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