项目总结报告-终稿(7)

⑵ 甘油生物转化生产二羟基丙酮

从50 余份来自不同地区的土壤中通过平板初筛与摇瓶复筛初步获得菌株30 余株，其中有三株(ZW12、ZL11、ZW23) 的转化活力较高，尤以ZW12 转化能力最好，镜检表明其为杆菌，通过对ZW12 生产DHA 的工艺条件的初步研究，可得如下结论：(1)该菌株的摇瓶培养和转化时间以60 h 为好，培养基的较佳初始pH 值为5. 5-6. 0；(2)将微生物培养20 h 后再投放甘油可以提高培养液中DHA 的含量；(3)对该菌种而言，培养基中甘油质量浓度以10 %较好,甘油质量浓度超过15 %，表现出转化率降低，如20 %则会抑制DHA 的产生，另外，发酵液中残留甘油太多会影响DHA 的提取纯化。 ⑶ 甘油转化生高附加值产品1,3-丙二醇

以克雷伯氏杆菌为研究对象，系统研究了1 ,3-丙二醇厌氧和微氧代谢途径。采用代谢通量分析法建立了代谢通量平衡模型，通过线性规划对1 ,3-丙二醇厌氧和微氧发酵进行了优化分析，得到其最优代谢通量分布和最大理论得率，并分析了比生长速率、底物浓度以及乙醇生成速率、氧气消耗速率、呼吸商对1,3-丙二醇得率的影响：(1)本文采用通量衡算模型, 以1 ,3-PD 理论得率为优化目标，分析了克雷伯氏杆菌发酵甘油转化成1,3-PD 在微氧和厌氧条件下的最优代谢途径和最大理论得率。在细胞比生长速率为0 时，得率最大，微氧条件下其最大理论得率为0.875 mol ·mol- 1 , 厌氧条件下为0.75 mol ·mol- 1。(2) 随着比生长速率的增加，1,3-PD 理论得率逐渐降低。在厌氧条件下，比生长速率对1,3-PD 理论得率的影响比微氧发酵大。当比生长速率由0 增加到0.66 h- 1 时，最大理论得率在厌氧条件下由0.75 mol ·mol- 1 减少到0.431 mol ·mol- 1， 在微氧条件下1,3-PD 理论得率由0.875 mol ·mol- 1 减少到0.788 mol ·mol- 1。(3) 对于厌氧发酵，在比生长速率比较小时，1,3-PD 理论得率随着乙醇生成量的增加而降低，当比生长速率比较大时，1,3-PD 理论得率随着乙醇生成量的增加先稍有增加再逐渐降低；(4) 对于微氧发酵，在不同的比生长速率下，存在一个最佳的通氧量和最佳的呼吸商。

2.6.3 发酵有机废物资源化

⑴ 发酵有机废物厌氧发酵高效产酸的预处理技术研究

由于发酵有机废物成分复杂，种类多样，有机质含量也不一样，为了达到最佳的有机质转化率及有机酸产率，需要对发酵有机废物进行预处理。研究了物理方法、化学方法和酶处理法方法等预处理技术对发酵有机废物转化率及有机酸产率的影响，确定热-碱预处理为最佳预处理方法。热-碱预处理的最佳条件为：污泥固体浓度73.6%，pH 12.0，温度100℃，处理时间120 min。 ⑵ 发酵有机废物定向产乙酸的两相耦合工艺研究

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基于对发酵有机废物厌氧发酵产酸系统中微生物菌群的分析，要得到较高的产酸量，必须先充分酸化。在产甲烷菌被抑制状态下，系统中对产乙酸有重要作用的产氢产乙酸菌和同型乙酸菌成为一对矛盾，前者需要较低的氢分压来拉动反应进行，而后者需要较高氢分压，即较高的底物浓度来进行产乙酸的反应。本项目提出两相耦合产酸新工艺，即将产氢产乙酸和同型产乙酸分别在两个不同的反应器中进行，通过连通装置将产氢产乙酸过程中生成的氢气和二氧化碳引入到同型产乙酸反应器作为底物供同型产乙酸菌合成乙酸，可以实现：①解除氢气和二氧化碳对产氢产乙酸菌的抑制；②充分实现同型产乙酸作用；③利于其他产物向乙酸的转化。艺定向产酸的微生物学机制；③两相产酸工艺定向产酸的应用研究。研究污泥厌氧产酸的工艺条件包括污泥停留时间(SRT)、有机物负荷(VOL)以及微生物生长条件包括温度、pH值、氧化还原电位(ORP)、微生物营养物质构成比等对有机物转化效率、有机酸的含量的影响。考察这些因素及因素之间的相互作用对酸化过程及目的产物在有机酸中的构成比的影响，从而确立了基于高产率与低成本为综合目标的最佳工艺条件，并建立发酵有机废物厌氧发酵产有机酸的数学模型。

⑶ 发酵有机废物厌氧产酸—好氧发酵生产纺织酶制剂的机制与过程优化

以嗜热子囊菌(Thermobifida fusca WSH03-11)发酵生产角质酶为模型，研究微生物利用发酵有机废物厌氧酸化所产短链有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可能。发现：(1)以丁酸、丙酸和乙酸为碳源时，有机酸和氮元素浓度分别为8.0 g/L 和1.5 g/L 有利于角质酶的生产；而以乳酸为碳源时，最适有机酸和氮源浓度分别为3.0 g/L 和1.0 g/L；(2)改变诱导物角质的浓度，以丁酸、丙酸、乙酸和乳酸为碳源，分别比优化前提高了31.0%、13.3%、43.8%和73.2%；(3)在四种有机酸中，T. fusca WSH03-11 利用乙酸的速率最快，平均比消耗速率是丙酸的1.3 倍，丁酸的2.0 倍及乳酸的2.2 倍；以丁酸为碳源时的酶活(52.4 U/mL)是乳酸的1.7 倍、乙酸的2.5 倍和丙酸的3.2 倍；角质酶对乳酸的得率(12.70 u/mg)分别是丁酸的1.4 倍、丙酸的3.0 倍和乙酸的3.8 倍；(4)以混合酸为碳源生产角质酶，T. fusca WSH03-11 优先利用乙酸，而对丁酸的利用受到抑制。进一步研究发现，混合酸中0.5 g/L 的乙酸将导致丁酸的消耗量降低66.7%。这是首次利用混合酸作碳源发酵生产角质酶的研究报道。这一研究结果进一步确证了利用发酵有机废物厌氧酸化所产有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可行性，为以廉价碳源生产角质酶奠定了良好的基础。 ⑷ 酶制剂的功能复配和在棉织物前处理中的应用

基于纺织酶制剂在退浆、精练和漂白过程中的应用特性、作用机理和动力学模型研究，以最佳处理效果、更强稳定性为目标，进行复合酶和酶复配组分的探讨，在不同规模进行酶的应用研究，并建立多种酶制剂应用于棉织物前处理的效

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果评价方法。采用酶处理工艺，棉织物酶法前处理质量达到白度>80, 毛效>9cm/ (30min), 强力损失<15%，不低于碱法处理，后整理质量比现有方法提高一个等级；污水总量减少1/3以上，COD值下降1/3-1/2，pH值直接达到排放要求；单位织物处理能耗下降1/3。

3、同国内外相关研究相比较，项目的研究工作的总体水平、突出进展、学术影响以及国内外同行专家的评价

（1）绿色工业生物过程高效全局优化原理（“以脂肪酶为催化剂的绿色化学合成工艺”，获得2008年国家技术发明二等奖（已公示））。

主要内容：具有转酯化或酯化功能的脂肪酶生产对于酶催化合成精细化学品有重要意义。脂肪酶催化有机合成具有条件温和、选择性高和环境友好的优点。国外NOVO公司已开始生产酯化专用脂肪酶如Lipolase及Lipozyme(IM) 等，但价格较高（1000－1500美元/公斤）。我国目前酯化反应全部应用酸或碱作催化剂，酯化用脂肪酶为空白。

① 选育了酯化用脂肪酶高产菌种。1吨发酵罐脂肪酶发酵水平达到8200 IU/ ml，实现了脂肪酶的国产化。构建了脂肪酶生产的基因工程菌，实现了酵母脂肪酶的高效表达。根据脂肪酶的部分氨基酸序列设计引物，PCR扩增得到脂肪酶成熟肽序列，将该序列克隆到pPICZαA载体中，然后转化到毕赤酵母中进行脂肪酶的分泌重组表达。利用质粒pPICZαA上的Zeocin筛选标记，通过高抗生素浓度（500μg/ml Zeocin）成功筛选得到脂肪酶高产菌株两个多拷贝菌株，在5L发酵罐内发酵液中酶活达到11000U/mL，提高了约160%；重组蛋白含量达到了2.3g/L发酵液。

② 发明了一种新的利用膜固定化脂肪酶新方法。针对废弃固定化酶的污染——固定化载体不能重复利用问题，采用廉价的无纺布及丝绸布等，通过表面改性，成功地使脂肪酶固定在廉价的膜布上，使用完后的膜布洗涤后可重复使用多次，打破了国际酶制剂巨头丹麦NOVO采用的树脂颗粒状固定化方法的专利垄断。固定化用最多可使用50批次，用过的载体洗涤后可重复使用。为工业化酶法合成工艺奠定了基础。

③ 构建了绿色催化平台。

A. 在国内外首先研究酶法合成棕榈酸异辛酯新工艺；目前该产品的工业化生产全部采用酸催化生产，三废多。我们首先酶发合成工艺，建立200吨/年酶

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法棕榈酸异辛酯的工业化装置，该工艺可减少废水排放量：8-10吨/吨产品。

B. 在国内外首先提出采用脂肪酶合成维生素A棕榈酸酯新工艺；维生素A棕榈酸酯国内外的生产方法全部为化学法，以?-紫罗兰酮或维生素A醋酸酯为原料合成维生素A 棕榈酸酯，经过复杂的多步化学反应，收率很低，对环境污染严重。发明了采用维生素A醋酸酯和棕榈酸通过酶法转酯化生产维生素A棕榈酸酯，转化率已达到90％以上，建立了2套工业化装置。固定化酶在使用50次转化率依然有85%以上。自制纺织物膜固定化酶结果优于商业化脂肪酶Novozym 435的转化率（77.5%）,同时也远高于目前化学法的转化率（75％），而且酶法条件温和，对维生素A没有破坏作用，大大提高了产品得率。经分离纯化后产品纯度达到95%，收率大于85%，该工艺(20吨产品/年)可减少废水排放量：12万吨/年，节省有机溶剂用量1100吨。

C. 发明了二元酸酯和多元醇酯的酶法合成新工艺。二元醇酯和多元醇酯是高档润滑油主要原料，目前主要采用化学法生在高温下反应，能耗高。首先发明了一种新的酶法绿色合成工艺，在常温下合成了二元酸酯和多元醇酯，并实现了产业化。打破了国外技术封锁。产品多元醇酯已用于我国三代改进型坦克润滑油，为我国国防事业提供了基础原料。申请2项国家发明专利（200710122200.4，200710120622.8）。

D. 发明了固定化脂肪酶连续催化生产生物柴油新工艺。开发了反应和分离耦合工艺生产生物柴油，转化率达到95%，同时可回收反应产生的甘油。并实现了批量生产，生物柴油质量达到国外产品标准。申请国家发明专利（200710063345.1）。

以脂肪酶为催化剂的绿色化学合成工艺实现了高效、低成本、低能耗、低排放的全局过程优化。

（2）生物转化过程优化新策略（“高纯度井冈霉素生物催化生产井冈霉醇的产业化技术开发”，获得2008年国家技术发明二等奖（已公示））。

筛选得到能够高效催化裂解井冈霉素并应用于大规模生产井冈霉醇胺的微生物新菌株，其生物催化活力居国内外最高水平；建立了生物催化新工艺，产业化中裂解产物井冈霉烯胺浓度高达2000μg/ml以上；研究了高纯度井冈霉素裂

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解产物分离新方法，缩短了工艺流程，解决了分离难题，产品收率从31%提高到76%以上。开发了井冈霉素新一代生产工艺用于高纯度井冈霉素的生产，100吨发酵罐井冈霉素A发酵效价从10000μg/ml提高到30000μg/ml以上，原料成本下降近70%，成为全球时空产率最高和成本最低的抗生素，建立了节能减排分离新工艺，能耗和废水排放减少20%以上，井冈霉素从10%以下的低纯度粗制品提高到60-90%高纯度制品。井冈霉醇胺作为关键中间体用于生产新一代酶抑制剂类糖尿病治疗药物，高纯度井冈霉素是生物农药新规格高端品种。本技术成功打破了国外技术和市场的垄断，具有自主知识产权，产品出口国际市场，高纯度井冈霉素国内外市场占有率第一。

（3）生化反应过程直接放大新方法（“先进技术集成的红霉素生产新工艺”，获得2008年省部科技进步一等奖（已公示））

以红霉素A为原料合成的第二、三代红霉素及其衍生物临床应用的扩大，已引起医药市场的注意。高吨位发酵罐的红霉素发酵水平、有效组分含量、过程高效节能和绿色生产就成为我国参与红霉素类产品国际市场竞争的关键因素。

项目围绕实现工业生产菌株的代谢工程改造，优化发酵液组分；以宏观代谢流分析与控制为核心实现发酵过程优化研究；实现了生理代谢特性和反应器流场特性相结合的发酵过程放大；建立膜分离和结晶技术相结合的提取技术，实现了红霉素节能减排的清洁生产工艺技术等四个方面突破。

创新点：(1)实现红霉素工业生产菌株代谢工程改造，使发酵液中红霉素有效组分A比例明显增加；(2)建立基于多尺度参数相关分析的红霉素发酵过程发酵过程动态优化与放大方法，大幅提高工业规模发酵水平和发酵指数；(3)提出反应器流场特性与菌体生理特性研究结合的放大原理，成功实现370m3发酵罐工程放大；(4)建立工业生产规模微滤、纳滤组合膜分离技术,实现节能、降耗、减排生产新工艺。

（4）工业发酵过程优化新方法（“棉织物前处理关键酶制剂的发酵生产和应用技术”，获得2008年教育部高校技术发明一等奖）

以嗜热子囊菌(Thermobifida fusca WSH03-11)发酵生产角质酶为模型，研究微生物利用发酵有机废物厌氧酸化所产短链有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可能。发现：(1)以丁酸、丙酸和乙酸为碳源时，有机酸和氮元素浓度分别

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