项目总结报告-终稿(3)

LC-ESI-MS, 对99种磷脂分子进行了定量研究。PCA和PLS都用于寻找可能的生物标志物。PA和LysoPC是造成剪切处理过的细胞和正常细胞之间差异的主要物质。进一步研究发现剪切力激活了PLD和PLC进而增加了剪切处理过的细胞中PA的含量。这些结果说明了磷脂及相关的磷脂酶在群体细胞对剪切力响应的机械信号转导中起了重要的作用。

2.1.2 细胞群体行为协同变化的调控机制

（1）细胞群体效应的分子调控机制

1) 基于调控群体行为的信号分子AHL及其相应的基因，利用标准化的生物砖 (BioBricks)，运用了这种生物体内的时间延迟效应，完成基因触发器设计，实现了该装置触发的特性，此基因电路融合了群体效应、荧光蛋白等生物体功能部件。

2) 构建了基于群体效应信号分子的，对氨苄青霉素和卡那霉素胁迫响应的大肠杆菌DH5α双菌株（ER和EG）人工共生体系。采用LC-MS-MS和GC-TOF-MS方法，确定ER细胞能够产生3OC6HSL信号分子，EG细胞能够产生C4HSL信号分子；研究表明，在ER和EG细胞组成的共生体系中，在高氨苄青霉素（4mg/ml）和卡那霉素(0.4mg/ml)条件下，ER和EG细胞延迟期增长，但ER细胞比EG细胞更具竞争优势；细胞初始浓度固定时，随着氨苄青霉素和卡那霉素浓度的增高共生系统稳定性降低，过高的浓度会导致此共生系统崩溃。当氨苄青霉素浓度为4mg/ml,卡那霉素浓度为0.4mg/ml时，ER和EG细胞最低初始浓度在2×106cells/ml左右就可维持此共生系统。

（2）信号分子对微生物胁迫抗性的调控

1）建立了基于化学诱变和进化代谢工程的丙酮丁醇梭菌随机突变方法，并构建了随机突变文库，研究了C. acetobutylicum SMB-1的丁醇耐受性，该菌能够耐受13 g/L丁醇。利用甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG）、硫酸二乙酯（Diethyl sulfate, DES）和乙基甲磺酸（Ethyl methane sulfonate, EMS）为化学诱变剂，分别用高浓度、高致死率及低浓度、低致死率两种策略；建立了丙酮丁醇梭菌进化代谢工程的操作方法，获得约含104突变子的基因组规模随机突变文库；以更高丁醇耐受性进行筛选，获得了耐受丁醇浓度提高到19 g/L的突变株20余株。

2）建立了基于酶标仪的高通量筛选方法：通过构建了基于酶标仪96孔液体培养的初筛模型，以与好氧/微氧条件下丙酮丁醇梭菌活性保护方法的结合，可以加快菌株突变文库评价和筛选特异表型突变株的速度；发现反应发生后生成的络合物在5分钟内是稳定的，在低温时反应可以用来测定丁醇；最终优选并确立了一种筛选方案。

10

（3）极端微生物胁迫抗性功能基因的发掘

1）完成了嗜碱单胞菌N10在不同Na+浓度条件下蛋白表达谱的差异蛋白质数据库的构建：通过将MALDI-TOF/TOF与De novo相结合，相互印证之后经统计分析发现在63个差异点中有39个差异点得到了鉴定，鉴定率为62%。其中发生下调的主要是与能量合成相关的蛋白及与氨基酸合成相关的蛋白，发生上调的主要是溶质转运蛋白及与细胞分裂相关蛋白。这些蛋白可能在细菌适应外界渗透压的升高的过程中发挥重要作用。

2）对ATP合成酶进行了初步研究

通过对嗜碱菌N10 ATP合成酶的beta亚基的基因进行表达、纯化和该蛋白的多克隆抗体的制备和相应的免疫学检测，以及该蛋白基因的mRNA水平进行分析，结果显示该蛋白在最适生长条件下表达量最高。进一步研究表明这种酶活性随pH值的升高而降低，该酶活性降低可能与该菌适应外界pH值的升高相关。 （4）链霉菌和乳杆菌规模培养的微生物群体效应研究

1）链霉菌发酵生产抗生素过程中的群体感应现象的研究：不同的接种密度（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍接种密度）研究表明当接种密度小于对照起始接种量15倍的时候，产物中并没有有效霉素的同系物积累，当接种密度大于或等于15倍的时候，此产物被检测到在发酵液中的存在。这结果可能是由于信号分子积累到一阈值导致了群体感应现象的发生所致。

回添高密度发酵培养基提取物研究表明加入了高密度发酵培养基提取物，能激发类似高密度发酵过程中有效霉素合成代谢的现象。有关高浓度有效霉素对发酵的影响以及群体信号分子对有效霉素发酵的影响，尚在进一步研究之中。

2）乳杆菌发酵中产BSH酶过程中的细胞群体效应的研究：考察了乳杆菌细胞群体效应的相关研究体系：以Bile Salt Hydrolase（BSH）酶为目标物和主要考察指标，建立了筛选方法，已筛选获得了2株植物乳杆菌菌株作为产生细胞群体效应的研究对象，至目前已经发现了乳杆菌在产BSH酶和热应激方面具有细胞群体效应现象的存在，现正进行重现性和定量化研究。

2.1.3 细胞群体效应的调控策略

（1）细胞群体效应过程调控与规模放大

1). 第一类信号分子AHLs为高丝氨酸内酯类物质，对于短链AHLs分子，在AHLs刺激下基因突变菌Chromobacterium violaceum CV026可产生紫色杆菌素，对于长链的AHLs分子，在AHLs刺激下细菌A. tumefaciens A136产生β-半乳糖苷酶。通过测定紫色杆菌素或β-半乳糖苷酶来间接测定AHLs信号分子。根癌农杆菌KYC6代谢产生3-oxo C8 AHL,因此可作为长链AHLs检测方法的阳性对照。文献报道克雷伯氏肺炎杆菌可产生AhlK内酯酶，可降解AHLs，从而

11

无法诱导β-半乳糖苷酶的产生，并无法使涂于表层的X-gal降解产生蓝色。

2). 海洋弧菌Vibro harveyi BB170在信号分子AI-2存在的情况下，可发光，但该菌本身不代谢产生AI-2，故选取该菌为AI-2信号分子的生物探针进行AI-2检测方法的建立。利用成熟的检测方法，对丙酮丁醇梭菌、克雷伯氏肺炎杆菌和阳性对照菌E.coli BL21(DE3)进行了AI-2的测定，结果发现丙酮丁醇梭菌代谢产物中不含信号分子AI-2，而克雷伯氏肺炎杆菌中含信号分子AI-2

2.2 多相生化特性分析及生物过程模型化

2.2.1 建立了先进的测试技术平台和模型、模拟平台

（1）无干扰流场测试技术之1－X射线CT技术

生物反应器一般为不透明的气液固三相体系，气相分布是理解生物反应器和进行反应器设计、优化的重要数据。常用的局部气含率测量方法多采取插入式光纤测量，但是考虑到生物体系易染菌和敏感于环境的特点，无干扰流场测试技术的开发和利用是研究生物反应器的前沿测试技术。

基于以上考虑，完全从理论出发，在轴对称流场的假设前提下，开发了简化的一维X射线CT测试技术;并在气液鼓泡柱中验证了方法的可行性，测试结果与文献结果获得很好的符合。下一步工作将应用X射线CT技术研究实际的生物发酵搅拌式反应器和环流反应器的相分布测量。 （2）无干扰流场测试技术之2－PIV流场测量技术

对3D-PIV测试仪器、高速相机（最快64000帧/秒）和连续激光器（1.5W）片光源发生系统进行整合，构建了PIV流场测量系统。实现了流场的2D速度场测量，并进一步获得剪切力场的数据。同时，还可以充分利用高速相机的功能，跟踪气液或者气液固体系内离散相的运动，包括形状变化甚至气含率测量。 （3）无干扰流场测试技术之3－PLIF浓度场和温度场测量技术

上述的高速相机和连续激光器系统还可以通过荧光物质的引入，利用激光诱导荧光的原理，测量生物反应器中液相的混合过程，可视化浓度场和温度场随时间的变化。这个先进的测量手段对研究微通道生物反应器作用原理、环流反应器和搅拌釜式反应器内的液相混合过程，尤其在不同的气泡浓度作用下的液相混合过程以及液相温度场的细微变化将起到重要的作用。 （4）无干扰流场测试技术之4－PLIF反应流测量技术

1.0Mixing vs. reaction extent1.0 mixing extent reaction extentMixing vs. reaction extent mixing extent reaction extent0.80.60.40.20.010152025303540450.80.60.40.20.01015202530354045

y, mm

y, mm

物理混合－反应混合－瞬态反应混合 射流:主流＝1:2，Re＝2000 射流:主流＝1:1，Re＝2000

12

图2 微通道反应流测量结果示意图以及混合与反应程度随流动发展的对比

在物理混合和物理传质测量的基础上，通过引入化学反应，可以通过PLIF技术实现液相反应流测量和液－液、气－液两相的反应流测量，从而深入理解混合、反应和流动在时间和空间尺度的匹配对反应进程的影响。尤其高速相机的引入，可以快速记录反应发生的每一个瞬间，深入认识微观的反应控制原理。

图2给出PLIF用于反应流测量的微通道液液混合－反应实验结果。 图3为搅拌釜中反应流测量结果示意图。随着搅拌强度的增加，混合和反应加快（结果不赘述）。

1.0 s

5.0 s

8.0 s

10.0 s

12.0 s

15.0 s

17.0 s

25.0 s

图3 搅拌釜反应流测量结果随时间和空间的演变（50 rpm）

（5）无干扰流场测试技术之5－高速相机和流场显微系统

使用高速相机，可以实现高时间和空间分辨率测量离散相的运动行为，尤其考察不同表面张力、不同粘度体系气泡的运动规律。图4所示为使用高速相机获得的气泡行为，实验中还考察了表面张力和粘度的影响。目前，已经配备了高速相机和流场显微系统，经过显微镜放大，可以实现空间分辨率为0.5微米、1000帧/秒的高速测量，将用于研究微通道生物反应器的实验研究。

气泡的生长过程

搅拌桨与气泡相互作用

上升气泡周围的速度场、X方向速度场和涡量场

图4 高速相机拍下的气泡运动行为

（6）先进的模型和模拟计算平台

基于MixSim、FLUENT和EDEM商用软件，已经可以实现复杂搅拌釜结构

13

的高水平网格划分、不同液相介质的搅拌釜流体力学模拟、气泡或颗粒为离散相而液相为连续相的流体力学模拟。最终希望实现基于离散相模型的气液固三相物理模型和3D模拟。图5所示为几种不同桨型设计下的搅拌釜模拟结果。

桨型 网格

Rushton

Lightnin

Chemineer

Pitched Blade

速度场 剪切速率场 甘油体系

CMC体系

水体系

图5 不同桨型和不同液相体系搅拌釜模拟结果示意图 2.2.2 具有低剪切力、高转速的搅拌式生物反应器的模拟

用CFX软件模拟研究直径为1m，体积为1.5m3发酵罐内的气液分散情况。发酵罐内流体的粘度随时间变化，最初阶段与水近似，随后粘度越来越高。并且发酵罐内微生物对高剪切敏感，所以需要低剪切，高流动的搅拌器。

首先模拟计算搅拌式生物发酵罐气-液两相的流场及气含率，然后进一步对气-液-固三相搅拌式生物发酵罐内气液分散及固液悬浮进行数值模拟，以模拟结果为依据，改进现有的实验装置及实验条件，达到低剪切高分散的效果。 模拟物系为水

以水为模拟物料，分别模拟计算了布气口向上和向下两种结构的发酵罐内的流场及气体分布情况。

气-液搅拌式生物发酵罐内流场的模拟

数值模拟单管布气开口向上发酵罐内液相的速度矢量如图6所示，布气开口向上发酵罐内液相的速度矢量模拟物系为水，通入25℃的空气，通气量为1.2m/min,转速为120rev/min,以相应的实验条件为基础设置.由图可以看出,两种结构的流场基本相同，都分成3个循环区，两层桨都是是径流式桨，流体从搅拌桨尖端出发向釜壁运动，碰到釜壁后分成两股分别向上和向下运动，向上部分从液面处向搅拌轴返回形成桨上方的流体环，而向下部分沿釜壁向下运动，碰到

14

3

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库项目总结报告-终稿(3)在线全文阅读。