大肠杆菌抗氧化应激反应的蛋白质组学分析(3)

2.3 试剂

LB（Luria-Bertani）液体培养基 氯化钠（NaCl） 10 g 蛋白胨（Tryptone） 10 g 酵母提取物（Yeast extract） 5 g

溶于800 mL去离子水中，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1 L，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。

LB固体培养基

在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.0 %，121 ℃高压蒸气灭菌20 min，铺制平板，4 ℃保存备用。

PBS缓冲液

NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4?12H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g

溶于800 mL去离子水中，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1 L, 121 ℃高压蒸气灭菌20 min。 膜蛋白提取液

50 mM Tris-HCl 150 mM NaCl 10% 甘油 0.8% Triton@X-100

向烧杯中分别加入50 mM tirs固体，150 mM NaCl固体，100 ml甘油，8 ml Triton@X-100，然后加入800 ml去离子水，充分溶解后，用pH计Delta320 测量PH，HCl调PH到 7.6，然后定容到1 L。 10%过硫酸铵（AP）

过硫酸铵 0.1 g

超纯水 1 ml

溶解后，4 ℃保存，保存时间为1周。（可先将过硫酸铵干粉称好放在EP管中，

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一次性多装几管，使用时加入超纯水即可） 1.5 mol/L Tris-HCl （pH8.8） TrisBase 45.43 g 超纯水 200 ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容到250 ml，室温下保存。 0.5 mol/L Tris-HCl （pH6.8） TrisBase 15.14 g 超纯水 200 ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容到250 ml，室温下保存。 30 % Acr/Bic

丙烯酰胺（Acr） 29 g 甲叉双丙烯酰胺（Bic） 1 g 超纯水至 100 ml

溶解后4 ℃保存，使用时恢复至室温且无沉淀。 10 % SDS

SDS 10 g 蒸馏水至 100 ml

50 ℃水浴下溶解，室温保存，如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 12%分离胶 (2块胶，10 ml)

超纯水 3.35 ml 30% Acr/Bic 4 ml 1.5 mol/L Tris-HCl （pH8.8） 2.5 ml、 10% SDS 100 μL

TEMED 3.3 μL/4μL（冬） AP 100 μL 4%浓缩胶（2块胶，5ml）

超纯水 3 ml 30% Acr/Bic 667 μL 1.5 mol/L Tris-HCl （pH8.8） 1.25 ml 10% SDS 50 μL

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TEMED 5 μL AP 30 μL

最后加AP，加完后立即混匀，灌胶。（为了加快凝胶，可以将AP和TEMED的量加大，一般为原来的2-3倍，视制胶环境温度而定） 电泳缓冲液

50 mM TrisBase 30.3 g 甘氨酸 144.1 g SDS 10 g

加800 ml超纯水充分溶解后，定容到1 L，这是10x的缓冲液。使用时需用超纯水稀释10倍。

样品loading buffer（2X） 100 mM Tris-HCl(pH6.8) 4 % (w/v) SDS 0.2 % (w/v) 溴酚蓝 20 % 甘油 (v/v) 200 mM 巯基乙醇

充分混匀，-20 ℃保存，使用前在沸水中加热1 min。 考马斯亮蓝染色液

考马斯亮蓝R-250 1 g 甲醇 450 ml 蒸馏水 450 ml 冰醋酸 100 ml 脱色液

乙醇 250 ml 冰醋酸 80 ml 超纯水定容至1L。

2.4 实验过程

2.4.1 大肠杆菌扩大培养[25]

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配置液体LB培养基分装到10支试管中，密封，每支试管约2 ml；100 ml固体LB培养基于250 ml锥形瓶，将这些培养基和洗干净的4个培养皿在121 ℃，1 MPa条件下灭菌20 min，于烘箱中烘干，在紫外线灭菌30 min的超净工作台中倒平板，从-80 ℃冰箱中取出大肠杆菌k12菌株，将4支装有2 ml左右LB液体培养基的试管放到超净台中，在酒精灯附近用20 μL的枪头蘸下，小心丢进试管中，放在37 ℃恒温摇床上培养过夜（约12 h）。

然后在超净台中，用灭菌后的接种环在固体培养基上划线，放到37℃恒温箱中过夜。待培养基上长出明显的菌斑时，在超净台中，用20 μL枪头挑取菌斑分别投入4支含有液体培养基的试管中，酒精灯烧一下管口，然后密封，在37 ℃恒温摇床上培养过夜（约12 h）。

2.4.2 氧化应激处理

在超净台中，将培养好的细菌分别倒入4瓶装有500 ml液体培养基的锥形瓶中，分别标号1、2、3、4。

将4个锥形瓶放在恒温摇床上，37 ℃，转速250 rpm培养，每隔半个小时，在超净台取1ml于分光光度计中，测量其OD600的值。经过大约3小时，1号OD600为0.5855，2号OD600为0.5654，3号OD600为0.5862，4号的OD600为0.6144。

取4个500 ml已灭菌的离心管，分别标号1、2、3、4。将锥形瓶中的菌液分别倒入对应的离心管中，每管约300 ml，在电子天平上称量，使每两管之间的重量误差在0.05 g以内，然后放到离心机中，4500 rpm，4℃离心10 min，小心倒去上清液，将剩下的菌液倒入对应离心管，重复上述步骤。

向每个离心管中分别加入30 ml PBS缓冲液，用1 ml枪轻轻吹打，使沉淀充分重悬，将重悬后的溶液用5 ml的移液枪转移到50 ml离心管中，分别标号1、2、3、4。

然后放到离心机中，4500 rpm， 4 ℃离心10 min，离心完毕后，小心倾倒去上清液。将四瓶装有500 ml PBS缓冲液的锥形瓶标号1、2、3、4，从中取出30 ml缓冲液加入到对应的离心管中，用5 ml移液枪充分吹打混匀，然后转移到对应编号的锥形瓶中。向1、2号锥形瓶中加入10 mmol过氧化氢溶液，轻轻摇晃混匀，把混匀的锥形瓶放到恒温摇床上，37 ℃，200 rpm孵育1小时。

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2.4.3 细胞破碎

将孵育好的大肠杆菌分别从四个锥形瓶取一部分（约300 ml）到500 ml离心管中，

在天平上平衡后，放入离心机，5000 rpm，4℃离心10 min，然后小心倾去上清液，将锥形瓶中剩余液体倒入离心管中，重复上述步骤，得到沉淀。

向每管中加入10 ml膜蛋白提取液，用移液枪轻轻吹打，充分混匀。然后将液体

转移到新的离心管中，分别标号1、2、3、4。

取一支管子插入装满冰块的烧杯中，放到超声破碎仪中进行超声破碎，超声时间

3 s，间隔5 s，功率40 %，超声180次，直到溶液澄清透明。

2.4.4 膜蛋白提取[26]

细胞破碎完全后，通过电子天平配平四支离心管，使误差尽可能小，放入高速冷

冻离心机，12000 rpm，4 ℃，离心20 min。

离心完成后将上清液（胞浆蛋白及膜蛋白）转移到特殊的离心管中,标号，通过天

平配平，使相对应的两组的质量误差不超过0.01 g。将转子小心地放到超速离心机中，23500 rpm，4 ℃，离心1 h。在离心管的底部有少部分的膜蛋白沉淀。

倒去离心后的上清液，加入少量的膜蛋白提取液轻轻冲洗，然后将管子倒扣在吸

水纸上析吸干，向离心管中加入200 μL的膜蛋白缓冲液，用200 μL的移液枪轻轻吹打，尽可能的少产生气泡，约20 min，蛋白沉淀充分重悬。分装到1 ml Eppendorf 管中，每管各装100 μL的膜蛋白混合液。对应标号，其中1、2编号的Eppendorf管中是过氧化氢处理后的膜蛋白，3、4编号的Eppendorf管中是对照的膜蛋白。将这些膜蛋白保存于-20 ℃冰箱中待用。

2.4.5 制胶 清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后，用自来水

冲洗干净，再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干。 灌胶：

1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃

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