大肠杆菌抗氧化应激反应的蛋白质组学分析

大肠杆菌抗氧化应激反应的蛋白质组学分析

摘 要

在细胞代谢过程中，部分电子逃逸出氧化还原系统，以氧分子作为电子受体，产生具有毒害作用的高能量活性氧分子（reactive oxygen species，ROS），包括超氧阴离子、单线态氧、过氧化氢、羟自由基和脂质过氧化的中间产物。活性氧是一种广谱杀菌剂，是宿主细胞抗菌作用的有效方式。但细菌在长期的进化过程中必然会发展出多种对策来抵抗宿主所产生的活性氧的杀菌作用。为检测与此相关的蛋白质，本研究主要通过正常及氧化应激条件下对大肠杆菌k12的培养，差速离心法提取膜蛋白进行SDS-PAGE，挖取具有明显差异的蛋白质条带，经胶内酶切处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)进行鉴定分析。结果鉴定到两种具有明显差异的蛋白，麦芽糖孔蛋白、外膜蛋白OmpA表达量明显下降，这两种蛋白主要与小分子物质渗透进入细胞有关，因此可以推测细菌为了适应周围环境的改变关闭膜上小分子通道，减少过氧化氢摄入细胞内，进而减少过氧化氢的毒害作用。通过本研究，我们可以初步阐明大肠杆菌的氧化应激机制。

关键词：活性氧；氧化应激反应；膜蛋白；MALDI-TOF MS/MS；过氧化氢

ABSTRACT

During the metabolism in the cell, oxygen molecules as an important electron acceptor, Also accompanied by some electronic escape from the redox system, produce some high energy reactive oxygen species which has poisoned, including superoxide anion (O2-), singlet oxygen, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, also includes the intermediate products of lipid metabolism. Reactive oxygen species (ROS) is a broad-spectrum fungicide. It is one of the effective way to host cell antimicrobial. However, bacteria in the long-term evolution development of a variety of strategies to resist the host immune bactericidal action. To detect which proteins associated with this system, in this study, mainly through training two group of the pathogenic E. coli, the one Treatment by hydrogen peroxide, the other one as the control group, Broken cells by ultrasound. Extraction the membrane proteins by differential centrifugation, make a SDS-PAGE electrophoresis with the Protein, Digging the significant difference protein band, after gel digestion, then identified by MALDI-TOF-MS/MS. We found two proteins which have significant difference, they are Maltoporin and outer membrane protein A (OmpA). Maltoporin and OmpA are associate to the small molecules penetrate into the cells. Therefore, we can speculate that to adapt to the environment Bacteria Close membrane channels of small molecules to reduce the intake of intracellular hydrogen peroxide, thereby reducing the toxicity of hydrogen peroxide. Through this experiment, we can initially clarify the oxidative stress mechanism of E. coli.

Keywords: Reactive oxygen species; Oxidative stress; hydrogen peroxide; Membrane

protein; MALDI-TOF-MS/MS

目 录

摘要 ABSTRACT

第1章 细菌抗氧化应激反应的研究进展 ......................................................1

1.1 蛋白质组学分析在细菌抗氧化应激研究中的应用 ................................................................ 1

1.1.1 金黄色葡萄球菌的蛋白质组学分析 .............................................................................. 1 1.1.2 幽门螺旋杆菌的蛋白质组学分析 .................................................................................. 1 1.1.3 枯草芽孢杆菌的蛋白质组学分析 .................................................................................. 2 1.1.4 在其他菌株上的蛋白质组学分析 .................................................................................. 2 1.2 蛋白质组学分析的概括 ............................................................................................................. 3

第2章 材料和方法 ..........................................................................................5

2.1 实验流程图 ................................................................................................................................. 5 2.2 材料及主要实验仪器 ................................................................................................................. 6 2.3 试剂 ............................................................................................................................................ 7 2.4 实验过程 ................................................................................................................................... 10

2.4.1 大肠杆菌扩大培养 ........................................................................................................ 10 2.4.2 氧化应激处理 ................................................................................................................ 10 2.4.3 细胞破碎 ........................................................................................................................ 11 2.4.4 膜蛋白提取 .................................................................................................................... 11 2.4.5 制胶 ................................................................................................................................ 11 2.4.6 样品处理 ........................................................................................................................ 12 2.4.7 SDS-PAGE分析 ............................................................................................................. 12 2.4.8 MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定 .................................................................................... 13

第3章 实验结果 ........................................................................................... 14 第4章 讨论 ................................................................................................... 18

4.1 过氧化氢的浓度 ....................................................................................................................... 18 4.2 质谱结果分析 ........................................................................................................................... 18

4.3 前景展望 ................................................................................................................................... 19

参考文献 ......................................................................................................... 20 致谢 ................................................................................................................. 23

第1章 细菌抗氧化应激反应的研究进展

1.1 蛋白质组学分析在细菌抗氧化应激研究中的应用

1.1.1 金黄色葡萄球菌的蛋白质组学分析

中性白细胞通过活性氧物质杀伤细菌，借助蛋白质组学方法可以发现不同菌株在

氧化应激中蛋白表达差异，以研究其抗氧化机制。Danchenko等[1]用LC-MS/MS技术对分别经H2O2处理后的RN6390和UAMS1两种金葡菌菌株蛋白质特征进行分析，发现了157种UAMS1菌株特有的蛋白，其中78种是未知的；有131种RN6390菌株特有的蛋白，其中17种是未知蛋白。这些差异蛋白将有助于对涉及去氧化毒性和毒力的相关机制进一步研究。Weber等[2]利用高分辨率的2-DE与MALDI技术分析了金葡菌COL菌株对氧化应激的特点。在指数生长期加入H2O2后，细菌出现生长停滞，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gap)、还原酶(AhpC)和酶(MvaS)的等电点明显改变。由于氧化应激的条件下ATP水平和Gap活性密切相关，因此H2O2引起的Gap活性失活可能是其生长停滞的原因之一。相反，Throup等[3]用2-DE研究了缺氧时srhSR基因突变株蛋白表达特征，发现srhSR剔除后导致了涉及到能量代谢和其他代谢过程如精氨酸分解、黄嘌呤分解以及细胞形态学的蛋白改变，提示葡萄球菌srhSR体系在应答氧获得性发生改变时能量转移的调节起重要作用。

1.1.2 幽门螺旋杆菌的蛋白质组学分析

游运辉[4]等利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离胃炎与胃癌相关幽门螺杆菌菌株的总蛋白质，凝胶经蓝银显色后，采用PDQuest图像分析软件比较、分析、识别差异表达的蛋白质，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质指纹图谱，然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。鉴定出14个差异蛋白质，包括抗氧化作用、分子伴侣、解毒和DNA修复相关蛋白质、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号传导相关蛋白质。

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