斑马鱼胚胎发育的分期 - 图文(4)

斑马鱼胚胎发育的分期

在激进插入发生的同时卵黄细胞也发生明显的形态变化，I-YSL表面向动物极膨出或是“隆起”，这一变化是外包开始最明显的标志（图8E），同时也大大增加了I-YSL与胚盘内表面的接触面积。卵黄细胞由于隆起而占据了深层细胞因激进插入而空出的区域，同时也对深层细胞的外移施加了驱动力。不论外包运动的结果如何，它都很明显同时包括了胚盘和卵黄细胞的运动，并且迅速发生。在随后的数小时内，随外包的继续，E-YSL也继续前行，穿过卵黄直达依附其上的细胞前方。至少在克鲤鱼，桥粒（desmosome）有助于将E-YSL和EVL边缘连接起来（Betchaku and Trinkaus, 1978），而不断伸展的YSL似乎将EVL丢在了后边。

外包似乎有赖于功能微管（Strahle and Jesuthasan, 1993）并可能受控于早期作用的合子基因（Kane, 1991）。目前已知最早表达的基因编码位于局部的推定转录因子（putative transcription factors）并在囊胚晚期表达（如notail基因，Schulte-Merker et al., 1992；goosecoid基因，Stachel et al., 1993；snaill基因，Thisse et al., 1993）。

在囊胚期EVL也发生变化。在卵裂期结束时EVL细胞数比深层细胞数多，但随着连续分裂EVL细胞数目大增，EVL变平、变薄，明显延伸最终形成密封的更难看到的上皮单层。囊胚晚期，EVL细胞周期比深层细胞周期更长，并表现出更少的同步性。同时EVL细胞也有了世系限制，其细胞分裂产生的子细胞总在EVL内。但其发育潜能在囊胚晚期似并未受到限制，如将其逐个移至深层细胞，其子代将获得新的分化方向。

囊胚期的分期

128-细胞期（2.25 h）.第8细胞周期始于128个细胞排列成高的细胞堆叠，位于卵黄细胞之上，呈紧密半球形。与早先卵裂不同，这一结束64-细胞期的卵裂沟很不规则，以至于此后几无例外无法从细胞位置推断其祖系。然而我们仍然可以判定某侧面观是对应于先前的奇数次卵裂面（正面观，见前文）还是偶数次卵裂面，因为胚体仍和4-细胞期描述的那样为椭球形。从正面观，EVL细胞在动物极和外围之间排列成约5个不规则的层。

256-细胞期（2. 5 h）.第8组卵裂结束时的正面观（图8A）显示EVL细胞形成7个不规则的层。在第９细胞间期，EVL细胞高度变薄，深层细胞数目大大超过了EVL细胞数目。第9次卵裂也是最后一次高度同步或间时同步的分裂。

512-细胞期（2. 75 h）.此期开始囊胚中期转变；细胞周期在后几次分裂中不断延长（图9A）。正面观，在动物极和外围之间有9个不规则的层。在此期的后半部尤其在正准备进入第10次有丝分裂时，外围细胞（第一层EVL细胞）失去其连接卵黄细胞的底部边界（图10A,B）。这一形态学变化预示着YSL形成的开始；外围细胞在第10次有丝分裂后特异性地不进行胞质分裂。第10次卵裂相当同步，以致我们在1分钟左右的时间里仍能看到所有细胞（包括卵黄细胞）都处于有丝分裂期（即无间期细胞核，图10C），512-细胞期是可能发生此类情况的最后一个细胞周期。

1 k-细胞期（3 h）.我们常可看到YSL形状不规则并将共约20细胞核包含在围绕胚盘边缘的单一环中（图10D）。第10次卵裂后的细胞数少于1024，因为在前一分期第一层（最外层）EVL细胞被并入了YSL。此外，还因为YSL的形成方式，此期组成第一层YSL的细胞是前一分期第二层YSL细胞的子细胞。

在某些胚胎，YSL经由两个细胞周期才形成，其开始时间可能早于也可能晚于1 k-细胞期。

YSL约有11层细胞。第11组有丝分裂的发生犹如波线穿过胚盘，这也是最后一次发生此种情况。在此期间，第一次可以看到许多细胞与其它细胞不同步，一些由间期细胞核，一些则没有。

高囊胚期（3.25 h）.此期标志着胚盘“高耸”于卵黄细胞之上的终结（图8B,C）。在外围细胞和YSL相遇处仍有一紧缩的环，或称缢痕。可以通过胚盘细胞和YSL细胞核的外形和数目来区别高囊胚期与其前面的分期。侧面观可见在外围和动物极之间有至少11层EVL细胞。在整个高囊胚期胚盘的任一区域总有一些细胞处于间期，而另一些细胞则处于有丝分裂期。大部分胚盘细胞已完成第12次合子细胞周期，而有一些在此期已完成第13个合子细胞周期。

YSL仍是薄的环形，但其外周轮廓更为平滑。YSL细胞核在其第2次分裂（第11次卵裂）时再次

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原肠期 (5.25-10h)

出现，通常仍都处于胚盘边缘之外，并相互包裹得更紧密（图10F）。

椭形期（3.66 h）.随着胚盘向卵黄的压缩，动-植物极轴变短。可以想象，这是由于表面持续增加的张力引起的。自从1-细胞期非卵黄细胞质升高开始形成的胚盘外围缢痕在此期减弱（图8C）直至消失。最终从侧面观胚盘变为轮廓平滑的椭球形，因而此期被称为椭形期。此时，卵裂高度不同步，其中许多处于第12或13次细胞周期。EVL此时极薄，须用Nomarski光镜仔细观察才能看到。

YSL在胚盘底部伸展开，同时也与胚盘分离。在此期间，YSL核形成数排，其中一些细胞核永久地留在了I-YSL。

球形期（4 h）.动-植物极轴的持续缩短使得囊胚晚期变为平滑的近球体。其整体形状在此后数小时内略有变化，很好地进入了原肠期，而细胞重排比以往任何发育阶段都要快。可通过对胚盘下部和卵黄细胞上部的I-YSL深层平面聚焦，根据其形状区分球形期与其后的穹顶期，在前者该平面是平的或近于平的（图8D）。

此期大部分胚盘细胞处在第13次细胞周期，在EVL,此期尤其长，以至于EVL中很少发生有丝分裂。E-YSL通常比前期明显变薄，大部分YSL细胞核是内在的。YSL发生最后一次核分裂。通常，去绒膜胚胎动物极开始竖起，而不是像先前那样倒在一边。

穹顶期（4.33 h）.I-YSL表面深入胚盘，开始向动物极隆起（图8E）。这一发生于卵黄细胞和胚盘界面的显著而快速的变化是外包运动开始的确切信号。EVL细胞处在较长的第13细胞周期，而许多深层细胞已进入第14细胞周期。E-YSL开始变窄（Solnica-Krezel and Driever, 1994）。YSL细胞核处于有丝分裂后期，也就是说，与穹顶期前的有丝分裂期相比，此时的细胞核总是可见的，它们开始变大，很容易看到。

30%-外包期（4.66 h）.外包运动，包括卵黄细胞的隆起，产生所谓的胚层（blastoderm），厚度几乎一致（图8F）。此时的胚层包括高度平坦的EVL单层（须用Nomarski光镜严格聚焦于胚层表面，否则不易见）和约4层细胞厚的深层细胞多层（deep cell multilayer , DEL）。

胚层包被卵黄的程度提供了极有用的分期指标。我们定义外包百分率（percent-epiboly）指从此期开始直至外包结束胚层所包被卵黄的程度。覆盖百分率（percent-coverage）可能会更准确地表达这一意思，但外包百分率着重于过程，且使用更为广泛。因此，30%-外包时，是指沿动-植物极轴估计，胚层边缘达动-植物极距离的30%。

此期许多胚胎的胚层厚度并不严格一致。由于囊胚绕动-植物极旋转，从侧面观察将会看到其边缘某一区域明显比其它地方薄而平。这一区域将发育为胚胎背侧（Schmitz and Campos-Ortega, 1994）。用低倍Nomarski光镜最容易观察到这一不对称性。然而要完全确定背侧尚需等到胚盾期（6 h）。

原肠期 (5.25-10h)

外包运动的继续，以及形态发生细胞的内卷（involution）、集合（convergence）和延伸（extension）运动的发生，产生了原始胚层和胚轴。

内卷运动的开始意味着原肠期的开始，目前可以说是发生于50%-外包时（图11A）。结果在达到50%-外包后的数分钟内出现了一个增厚的外围区域，称作胚环（germ ring），几乎与此同时完全包围了囊胚边缘（图11B，及C箭头所指）。随后集合运动几乎同样快速地沿胚环产生一个局部的堆积，称胚盾（embryonic shield , 图11D，及E箭头所指）。在发生这些事件期间，外包暂时中止，但胚盾形成后外包又继续。胚层边缘沿卵黄细胞延伸直至将其完全包绕（图11F-L）。其延伸近乎恒定速度进行，约每小时包绕卵黄细胞的15%，这也提供了大部分原肠期分期的有用指标（图12）。

正因为囊胚期没有囊胚腔，原肠期既没有消化道（archenteron），也没有胚孔（blastopore）。DEL细胞在胚层边缘进行内卷，因而发挥了胚孔的作用。内卷通过将胚层向后折叠形成胚环。因此，胚环内由两个胚层：位于上方的称上胚层（epiblast），在整个原肠期继续给位于下方的下胚层（hypoblast）提供细胞。注意到上、下胚层这些术语可同样描述鸟类胚层结构，但所命名的胚层在这两种脊椎动物中似乎完全不同。

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斑马鱼胚胎发育的分期

图 11 . 原肠期发育。除特别标注外均为左侧观，前侧朝上，背侧朝左。A：50%-外包期（5.25h）；B：胚环期（5.7h）；C：动物极观胚环期，箭头指示胚环，胚盾将发育于胚环右下方的平坦区域；D：胚盾期（6h），胚盾标志背侧，是胚环左侧增厚区域；E：动物极观胚盾期，箭头指示胚盾；F：70%-外包期（7.7h），左边的胚层背侧比右侧的胚层腹侧厚，前轴下胚层或脊索前板（prechordal plate，箭头所示）延伸近动物极；G：70%-外包期腹侧观，但微向前侧倾斜以显示此时很明晰的轴下胚层（箭头所示）的脊索前板；H：75%-外包期（8h），箭头示腹侧薄的排泄区；I：80%-外包期（8.4h）背侧观，箭头示轴中胚层与中线边界，近轴中胚层在其一侧；J：90%-外包期（9h），在一些胚胎中可见尾芽（箭头所示）；K：90%-外包期腹侧观，前侧脊索前板（对比G）增大为小膨出；L：尾芽期（10h），箭头示小膨出，短箭头示尾芽，尾芽腹侧（即此图左侧）的显著区域显示外包结束时卵黄消失处。比例尺=250μm

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原肠期 (5.25-10h)

图 12. 外包期间胚层边缘覆盖卵黄前行的速率理想曲线（在28.5℃）。外包百分率指的是被胚层覆盖的胚胎（胚层加卵黄细胞）占整体的份额。在6.66h之后，其速率相对恒定，约为每小时外包15%。我们观察了一起发育的多组胚胎（每组约12个）而获得这些数据，此处忽略了胚胎中可能的变异。 发育时间（h） 外包百分率作为形态发生运动，胚层边缘的内卷似乎很好地证明了一种硬骨鱼玫瑰无须鲃（rosy barb）的发育在很多方面与斑马鱼极为相似（Wood and Timmermans, 1988）。然而J.P Trinkaus 最近获得了一些资料（尚未发表）证明克鲤鱼的胚胎根本不发生内卷，相反，近于表面的细胞独自由表面向深部迁移，而不是以整个细胞层进行卷动。这一运动称内移运动（ingression），也可能在斑马鱼中发生（J. Shih and S.E. Fraser，尚未发表），这是用高分辨率的时滞分析对Wood和Timmermans曾观察过的整个细胞野做进一步研究所得。

随着细胞向内运动，一条裂沟称Brachet裂缝在Nomarski光镜下开始变得可见（图13），在横断面位于上下胚层之间。我们在75%-外包期的图1中指出了这一裂缝的所在，但用立体显微镜常不易定位（对比图11和13）。正常情况下，胚层的细胞不会跨过Brachet裂缝进行融合（不过实验条件下可能，见下文）。两胚层内的细胞以各自不同的方向进行流动。除背侧区域（见下文），上胚层通常向外侧流动，而达到外围后又向内运动进入下胚层。然后，作为下胚层细胞游离外围（Warga and Kimmel, 1990）。原肠期结束时仍留在上胚层的细胞相当于最后的外胚层（ectoderm），将产生诸如表皮、中枢神经系统、神经嵴以及感受基板等组织。而下胚层将产生中胚层（mesoderm）和内胚层（endoderm），Thisse等（1993）称之为“内中胚层”（“mesendoderm”）。两个名称都强调了在原肠期的任一分期都不存在三个独立的胚层，只有两个。环绕大部分胚胎周围的下胚层此时只有一两层细胞厚（图13），目前尚不知其何以分化成内胚层和中胚层。

之间，再聚焦，大致在动植物极中线处获得此光学剖面图。因而，此图是沿胚轴观察而得，中心为中线结构。上面的细胞中胚层覆盖下面的卵黄细胞。EVL在此期极薄，不可见（但在表面观可见）。箭头示上下胚层的显著边界Brachet裂缝。上胚层似为厚度几乎均一的多层细胞，但实际上此时它可能正在形成单细胞层的假层上皮（pseudostratified epithelium，Papan and Campos-Ortega, 1994）。下胚层夹在上胚层和YSL之间。远离背中线（例如箭头附近区域）近轴中胚层似为单层立方细胞。特别在中线区域Brachet裂缝较不明显，轴下胚层增厚，可能包含不止一层细胞。随后，轴下胚层将同时贡献于中胚层（如脊索）和内胚层。比例尺=50μm

图 13 . 原肠中期胚胎的背侧胚层，75%-外包期，Nomarski光镜。我们将胚胎植物极朝上，轻轻平放于两盖玻片

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斑马鱼胚胎发育的分期

在4h时的球形期EVL发生世系限制之后的约1小时，许多DEL细胞（并非全部）也有了世系限制，将发育为某个组织或特定的器官。世系限制发生于原肠期开始时（Kimmel and Warga, 1987; Kimmel et al., 1990b, 1994）。与早期EVL世系限制不同的是，原肠早期DEL细胞的世系限制并不伴随细胞的定型（Ho and Kimmel, 1993）：如果将DEL细胞逐一从通常产生中胚层和内胚层的外围区域移植到通常形成外胚层的动物极区域，它会同时改变其形态和发育方向，与其周围的细胞没有区别。发育调节的能力可能包括合子表达模式基因（zygotically expressed patterning genes）活动的动态调节：外围细胞特异性表达的notail基因（ntl）和鼠的T/Brachyury基因是同源基因，可编码一种核蛋白（Schulte-Merker et al., 1992），是正常的脊索发育所必需的（Halpern et al., 1993; Schulte-Merker et al., 1994）。从外围转移到动物极的细胞迅速关掉ntl基因的转录，而作反向转移的细胞则立即打开。然而到原肠中期，细胞如此灵活的调节能力似乎丧失，因为此期从下胚层转移到上胚层的单个细胞会迅速离开新转移的位置，重新回到下胚层，并以下胚层的发育方向发育。为完成这一行为，被转移的细胞必须穿过Brachet裂缝，而时滞分析显示，完成这一不寻常的行为似乎毫无阻碍。

原肠期一开始，器官-组织命运图就确定了（图14）。通过给单个细胞注射世系追踪染液，随后探测其带有标记的后代细胞位于哪个器官的哪个区域，并根据细胞的形状、大小和位置确定其形成了哪些分化类型。从拓扑学角度讲，这一命运图和其他脊索动物（chordates）很相似，尤其是两栖动物（Keller, 1975; 1976; Dale and Slack, 1987）、鸟类（Hatada and Stern, 1994）以及哺乳动物（Lawson et al., 1991）。在DEL内，原始胚层的命运由纬度（相对动物极和外围细胞的位置）确定，而组织原基可参照纬度和经度（相对背部中线的位置）共同确定。图中尚不明显的另一个显著特征是，沿原肠期的背腹（DV）轴位置通常对应于随后的咽囊期沿前后（AP）轴的位置。三个胚层都是如此：最终在脊髓（外胚层）、肌肉（中胚层）以及胃壁（内胚层）中AP细胞位置均对应于原肠早期DV细胞位置。DV-AP转变过程中的形态发生是复杂的，大部分尚不明了。考察神经外胚层的命运图：我们所看到的复杂性不仅在于其前侧神经命运图相对应于原肠期的背侧，更在于其腹侧神经管、运动神经元和底板的细胞种类也相对应于此同一区域——原肠期的背侧（Kimmel et al., 1990b）。我们随后讨论原肠期的背侧细胞何以最终变为神经管中的腹侧细胞，但仅仅在命运图这一区域背侧与前侧的相对关系却尚不清楚。在原肠期或原肠期后的形态发生期间驱散克隆系细胞（也是位置相关细胞），就难以形成缜密的命运图，但情况并非总是如此。例如Stainier等（1993）证实单个囊胚晚期细胞的后代可能会参与构建心房或心室，但若驱散其细胞系，它们就会同时形成两个心腔。

图 14 . 原肠期一开始的深层细胞多层（DEL）命运图；在胚环和下胚层形成前的50%-外包期。胚层此时形如倒置的半球形杯覆盖卵黄之上（见图1, 11B）。EVL细胞只贡献于胎皮（periderm），而严格来说尚无卵黄细胞（包括YSL）来源的组织或器官。因此所有已知的组织器官均源于DEL，但尚不知此期DEL中的细胞深度是否与发育命运有关。外胚层命运图最靠近动物极，中胚层命运图位于外围广阔的环中，而内胚层命运图与此环在胚层边缘处重叠。为求清晰，此处并未显示所有器官原基，如，孵化腺发育于背侧边缘区域与咽重叠；肌肉沿胚层近边缘的两边和腹侧延伸，而内皮（endothelium）源于更广阔的中胚层区，包括所有经度——背侧、两边和腹侧。胃、胰和鳔在两边发育，近于肝，而平滑 肌近于心脏发育。中鳍和胸鳍都发育于同一腹侧区

域。本图基本轮廓源自Kimmel et al. (1990b)，经由 Company of Biologists Ltd.惠允。 19

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