斑马鱼胚胎发育的分期 - 图文

斑马鱼胚胎发育的分期

CHARLES B. KIMMEL, WILLIAM W. BALLARD, SETH R. KIMMEL等 原著

俄勒冈大学神经生物学学院；达特茅斯学院生物系 黄万旭 译

浙江大学生命科学学院

摘要：我们对斑马鱼（zebranfish, Danio rerio）胚胎发育的分期作了一系列的阐述。我们定义了

胚胎发育的七段时期（period）——合子（zygote）、卵裂（cleavage）、囊胚（blastula）、原肠（gastrula）、分节（segmentation）、咽囊（pharyngula），以及孵化期（hatching period）。这一划分强调了发生于受精后头3天的主要发育过程中的变化情况，同时我们也回顾了发生于每一时期的诸如形态发生及其他主要事件。时期的下一划分单位是分期（stage）。各分期都有名称，而非标号，反映了分期序列的灵活性和持续演变过程，因为我们从这一物种中还能得到更多。各分期的命名是基于用解剖立体显微镜（dissecting stereomicroscope）观察活体胚胎所容易观察到的形态学特征为依据的，同时也充分利用了活体胚胎的透明性，这一性质使我们可以用组合显微镜（compound microscope）和Nomarski干涉相差照明（Nomarski interference contrast illumination）观察到即使很深层的结构。显微照相（photomicro- graphs）和组合显微描图（composite camera lucida line drawings）则以图片刻画了每一分期。此外还有一些图像则显示了发育过程中一些可用作分期辅助标志的显著特征。

关键词：斑马鱼，形态发生，胚胎发生，合子，卵裂，囊胚，原肠，分节，咽囊，孵化

目 录

概 述 ................................................................................................................................................................ 1 全文组织结构 .................................................................................................................................................. 1 步 骤 ................................................................................................................................................................ 3 温度与标准发育时间 ...................................................................................................................................... 8 合子期（0-0.75h） .......................................................................................................................................... 9 卵裂期（0.75-2.25h） ..................................................................................................................................... 9 囊胚期（2.25-5.25h） ................................................................................................................................... 12 原肠期 (5.25-10h) ......................................................................................................................................... 16 体节期（10-24h） ......................................................................................................................................... 21 咽囊期（24-28h） ......................................................................................................................................... 33 孵化期（48-72h） ......................................................................................................................................... 42 早幼期 ............................................................................................................................................................ 48 谢 辞 .............................................................................................................................................................. 48

斑马鱼胚胎发育的分期

概 述

分期为发育研究提供了准确度。这是因为不同的胚胎即使在同一群体中一起生长，其发育亦有不同程度的差异，我们已看到在斑马鱼发育过程中出现的不同步性。体外同时受精产生的胚胎，孵育于温度合适的稀疏环境（28.5℃，5-10个胚胎/ml），最早期即出现不同步性，并随时间延续愈加显著。通过对比显示，不同群体中的差异比同一群体中的更大。基因差异能部分说明而不能完全解决这一问题，因为即使来自同一斑马鱼克隆系的胚胎其发育亦有不同步性。

就不同胚胎而言，通过形态学标准分期可部分解决这一问题。例如，头部的原始三叉神经感受神经元（primary trigeminal sensory neurons）和躯干的原始运动神经元（primary motoneurons）都是在体节连续沿体轴出现这段时期内开始轴突发生的。通过体节数目分期比通过受精后逝去的时间分期能更准确地预测这些神经元在发育过程中的位置。参照分期序列来记录实验能提供很好的方式确保实验的再现性，并允许随后加入新的观察结果和数据。一系列基于形态学的划分同时也有利于交流，“18-体节胚胎”比“受精后18小时胚胎”这一称谓含有更丰富的意义，尤其在交叉物种比对中。

以往的斑马鱼发育分期尽管不如目前的完善，也相当准确地反映了头一天的胚胎发育，并提供了多组有用的图片（Hisaokaand Battle, 1958; Hisaoka and Firlit, 1960）。Warga 和 Kimmel （1990）简要地描述了囊胚期和原肠期。本系列分期的先前版本见于已出版和发行的《斑马鱼手册》（The Zebrafish Book，Westerfield,1994）一书。新版做了细微的修正和补充，更新版本可以电子版形式在http://zfish. uoregon.edu获得。

表1. 早期发育的各时期

时期 合子 卵裂 囊胚 原肠 分节 咽囊 孵化 早幼

h 0 0.75 2.25 5.25 10 24 48 72

细胞周期2至7快速同步发生

快速间时同步（metasynchronous）细胞周期（8，9）在原肠中期转变中变为延长的异步（asynchronous）周期；随后外包（epiboly）开始

内卷（involution）、聚合(convergence)和延伸（extension）等形态学运动形成上、下胚层和胚轴；持续到外包运动结束

体节、原始咽弓和神经原节（neuromeres）发育；原始器官发生；开始运动；尾部出现

种系期（phylotypic-stage）胚胎；体轴由先前绕卵黄囊的弯曲状态开始伸直；循环系统、色素沉着和鳍开始发育

原始器官系统完成快速形态发生；软骨在头和鳍中发育；陆续开始孵化 鳔膨胀；觅食及积极的躲避行为

描述

新受精的卵子完成首个合子细胞周期

全文组织结构

我们命名了每一分期，而不是像其他序列那样使用数字编码，因为命名的分期更为灵活且易于记忆和识别。分期的定义不是一个瞬间的时刻点，而只是一个用以近似定位连续发育过程中一小段时间的手段。有了分期命名，我们就可以很容易地加入所知细节，或是为了某一特定的研究在序列中插入一个新的分期，而无需求助于诸如小数、负数、正数这类令人生厌的工具。例如：我们现在描述了一个5-，随后又描述了一个14-，但一项特定的研究可能要用到其间的8个分期（6-体节，7-体节等等），此时我们可以立刻明白其含义（而不必再行描述）。我们强调的是，这里不作描述并不意味将其排斥于分期之外。

1

全文组织结构

表2. 胚胎发育的分期a

分期 合子期

1-细胞

0 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.33 3.66 4 4.33 4.66 5.25 5.66 6 8 9 10

1，2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

胞质流向动物极，形成胚盘 部分卵裂 2×2排列的卵裂球 2×4排列的卵裂球 4×4排列的卵裂球

规则的2层卵裂球，有时4×8排列 规则的3层卵裂球

5层卵裂球；卵裂面不规则 7层卵裂球

9层卵裂球；NO：YSL形成

11层卵裂球；NO：单排YSL核；卵裂细胞周期轻度不同步 >11层卵裂球；胚盘开始变平；NO：2排YSL核；分裂不同步 胚盘变平产生椭球形；NO：多排YSL核 球形；胚盘与卵黄之间为水平边界

仍为球形；当外包开始时，卵黄细胞向动物极顶起 胚层如倒置杯状不均一增厚；边缘达动植物极距离30% 胚层厚度仍不均一

胚环在动物极可见；50%-外包 胚盾在动物极可见；50%-外包

背侧明显增厚；可见上下胚层和排泄（evacuation）区 脑原基增厚；脊索原基从节板分离

尾芽显著；脊索原基从神经突（neural keel）分离；早期小膨出（polster）；神经突前侧出现中间矢状沟；100%-外包

h HB 描述

卵裂期

2-细胞 4-细胞 8-细胞 16-细胞 32-细胞 64-细胞

囊胚期

128-细胞 256-细胞 512-细胞 1k-细胞 高囊胚 椭形 球形 穹顶 30%-外包

原肠期

50%-外包 胚环 胚盾 75%-外包 90%-外包 尾芽

体节期

1-体节 5-体节 14-体节 20-体节 26-体节

10.33 11.66 16 19 22 24 30

18 19 20

第一体节沟

小膨出显著；视囊，Kuperffer囊

EL=0.9mm；眼基板；脑神经元，V形躯干体节；NO：前肾导管

EL=1.4mm；0.5

EL=1.6mm；HTA=125°；侧向条纹；耳石（otoliths）；原基-3

EL=1.9mm；HTA=120°；OVL=5；YE/YB=1；视网膜和皮肤早期色素沉着；中鳍折叠；卵黄血红细胞；心脏搏动

原基-15

EL=2.5mm；HTA=95°；OVL=3；YE/YB>1；YB/HD=2;早期触碰反射和简单的应激运动；视网膜色素沉着；背侧条带达12体节；弱循环；主动脉至尾端一半；主静脉编织；浅胸鳍芽；直尾；NO：尾端细胞退化；第1大动脉弓血液循环

原基-25

36

EL=2.7mm；HTA=75°；OVL=1；PF(H/W)=3/4；早期运动；尾部色素沉着，背部条纹加深；强循环；单一大动脉弓对；主静脉达尾部3/4； NO：PF顶端上胚层缘

咽囊期

原基-5

2

斑马鱼胚胎发育的分期

高胸鳍 42 EL=2.9mm；HTA=55°；1/2

孵化期

长胸鳍

48

EL=3.1mm；HTA=45°；OVL=1/2；PF(H/W)=2；背上位静息；YE开始变细，PF突出；背腹侧条纹汇于尾部；侧带约6个黑素细胞；视网膜上虹膜色素细胞丰富；头部显著黄色；NO：循环见于2-4大动脉弓及血管段；嗅觉纤毛摆动；半规管（semicircular canal）；神经丘（neuromast）

胸鳍 60 EL=3.3mm；HTA=35°；运动迅速难以分辨；YR变细融入YB；侧带约10个黑素细胞；PF变平成鳍形，有明显的循环；视网膜虹膜色素细胞环加深；虹膜色素细胞出现于背侧；NO：PF软骨和角质鳍条（actinotrichia）；肠道；耳囊分2腔；早期颌软骨；循环于5-6大动脉弓；口仍小，开于腹侧眼中线 突口 72 EL=3.5mm；HTA=25°；宽口突出于眼前方；虹膜色素细胞出现于卵黄带；虹膜色素细胞覆盖眼部一半；背部黄色与头部色调同；NO：腮裂和腮丝芽基；腮弓1-5软骨；鳃盖覆住1-2腮弓；匙骨（cleithrum） a EL：胚体长度；PF：胸鳍；HB：Hisaoka 和 Battle (1958)斑马鱼分期大致序列（一直到HB分期20大致准确）；HD：

背侧观头部直径；NO：Nomarski optics；H/W：高/宽；YB：卵黄球；YE：卵黄延伸部；YSL：卵黄合胞体层；HTA：头-肢角；OVL：耳囊长度

为从更广的视角观察发育过程，我们将数个分期归为一组，形成更长的时间段称为时期（表1），

并在文中总结了发生在这些时期内的主要事件。术语表中定义了一些特定的术语，文中黑体字强调的术语在分期中是重要的。表2对各个分期作了简要的描述，而图1则展示了相应的草图。我们可以利用这些资料大致定位我们所感兴趣的一个分期，然后尽可能在文中和其他图中找到更多细节。

步 骤

分期

我们可以通过使用立体显微镜观察活体胚胎来大致确定发育分期，通常用透射光（而非反射或入射光）以及高放大倍数（约50×）。在体节期尾部伸长，如果胚胎仍处于绒膜（chorion）内，尾部最终将环绕驱干和头部，以致不易观察。此时，我们必须将胚胎移出绒膜，可以使用5号镊子（forceps）手工移去，也可用蛋白溶解酶（proteolytic enzyme）处理。咽囊晚期，一旦受到触碰，胚胎（如已去除绒膜）会反射性游走，这种情况下，可用0.003%三卡因（tricaine）以麻醉之。反复麻醉和冲洗会严重阻滞随后的发育，虽然看起来似乎轻微。

Nomarski光学系统

装有Nomarski微分干涉相差光学系统和倍率15至40的物镜的组合显微镜能揭示活体标本更多的细节，利于精确分期。例如，Nomarski光学系统可在囊胚期和体节期实现最精确的细胞和体节计数。此外，“原基”期（”prim” stages）指后侧线原基（primordium of the posterior lateral line）这一结构的位置，我们必须利用Nomarski光学系统以准确确定大部分咽囊期的一些分期。将胚胎麻醉、去除绒膜，并置于桥接盖玻片之间以利于观察和随后的恢复。

3

步 骤

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