有关物质方法验证

有关物质方法验证（以HPLC法为例）

（1）系统适用性试验

系统适应性试验主要是考察主成分与杂质的分离情况以及主峰参数信息，如理论塔板数、拖尾因子、分离度等，均应符合测定要求。

空白溶液、自身对照溶液、供试品溶液各进1针。 系统精密度

自身对照溶液连续进样6次，峰面积RSD不大于2%，保留时间RSD不大于1% 。

（2）专属性

专属性系指在其它成分可能共存的情况下，采用的方法能准确测定出被测杂质的特性。对于原料药，可根据其合成工艺，采用各步反应的中间体（尤其是后3步反应的中间体）、非对映异构体、特定杂质、粗品等作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求，从而验证分析方法对工艺杂质的分离能力。对于制剂，重点控制降解杂质。

专属性试验（用二极管阵列检测器） 1、原料药 溶剂 自身对照 供试品 起始原料 合成中间体

特定杂质（可能会与起始原料和合成中间体重复）

混合样：将起始原料、合成中间体、特定杂质加到供试品溶液中。特定杂质的浓度一般同限度浓度，起始原料和合成中间体的浓度一般同自身对照的浓度（如果浓度过高，可能会有杂质峰干扰）。

以上样品各进一针，主要考察色谱条件能不能有效检出杂质，以及各个峰之间的分离情况，特别是主峰和特定杂质峰与相邻杂质峰的分离情况。

注：在现有标准的色谱条件下，如果有的起始原料和合成中间体的峰与主峰

的分离度不符合要求或者保留时间过长，只要起始原料和合成中间体不是降解产物，可以用其它合适的色谱条件单独控制，如果粗品中未检出，以后可以不在控制。

破坏试验

酸、碱、高温、光照、氧化、金属离子（选做。一般用铁离子，因为最有可能接触到）。为了便于比较，同时进未破坏的样品。

空白：酸碱空白、氧化空白，处理过程与样品的最终破坏条件相同。 热破坏：一般将样品溶液水浴加热或固体样品高温放置。

光照破坏：如果已经做过影响因素试验，可用光照10天的图谱代替。 氧化破坏：双氧水由于响应值较强，一般浓度不必太高，一般用几滴即可，必要时可以加热。

酸碱破坏：一般先采用较低浓度的酸碱（如：0.1mol/L）溶液，加入体积不宜过大，必要时可以水浴加热，放冷后调至中性（特别是碱破坏样品，绝对不能直接进样!），然后用标准中溶剂稀释，若样品不澄清则要滤过。

2、制剂 溶剂 空白辅料 自身对照 供试品 特定杂质

混合样：将特定杂质加到供试品溶液中。特定杂质的浓度一般同限度浓度，若没有限度浓度，可暂定为供试品溶液浓度的1% 。

以上样品各进一针，主要考察色谱条件能不能有效检出杂质，以及各个峰之间的分离情况，特别是主峰和特定杂质峰与相邻杂质峰的分离情况。

破坏试验

酸、碱、高温、光照、氧化、金属离子（选做。一般用铁离子，因为最有可能接触到）。为了便于比较，同时进未破坏的样品。

辅料破坏： 酸、碱、氧化破坏，处理过程与样品相同(用最终的破坏条件做)。 热破坏：一般将样品溶液水浴加热或固体样品高温放置。

光照破坏：如果已经做过影响因素试验，可用光照10天的图谱代替。 氧化破坏：双氧水由于响应值较强，一般浓度不必太高，一般用几滴即可，必要时可以加热。

酸碱破坏：一般先采用较低浓度的酸碱溶液，加入体积不宜过大，必要时可以水浴加热，放冷后调至中性（特别是碱破坏样品，绝对不能直接进样!），然后用标准中溶剂稀释，若样品不澄清则要滤过。

2、复方制剂（两种成分且用相同的色谱条件同时测定有关物质） 溶剂 空白辅料 自身对照 供试品 特定杂质

混合样：将特定杂质加到供试品溶液中。特定杂质的浓度一般同限度浓度，若没有限度浓度，可暂定为供试品溶液浓度的1% 。

以上样品各进一针，主要考察色谱条件能不能有效检出杂质，以及各个峰之间的分离情况，特别是主峰和特定杂质峰与相邻杂质峰的分离情况。

破坏试验

酸、碱、高温、光照、氧化、金属离子（选做。一般用铁离子，因为最有可能接触到）。为了便于比较，同时进未破坏的样品。

辅料破坏： 酸、碱、氧化破坏，处理过程与样品相同(用最终的破坏条件做)。 热破坏：一般将样品溶液水浴加热或固体样品高温放置。同时做原料(用最终的破坏条件做)，以便进行杂质归属。

光照破坏：可用光照10天的样品。同时做原料，以便进行杂质归属。 氧化破坏：双氧水由于响应值较强，一般浓度不必太高，一般用几滴即可，必要时可以加热。同时做原料(用最终的破坏条件做)，以便进行杂质归属。

酸碱破坏：一般先采用较低浓度的酸碱溶液，加入体积不宜过大，必要时可以水浴加热，放冷后调至中性（特别是碱破坏样品，绝对不能直接进样!），然后用标准中溶剂稀释，若样品不澄清则要滤过。

同时做原料(用最终的破坏条件做)，以便进行杂质归属。

（3）检测限（主成分和订入标准的特定杂质）

检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，是反映分析方法灵敏度的一个重要指标；检测限不得大于该杂质的报告限度（报告限度一般为0.05%），以保证检出需控制的杂质。

测定方法1：取待测物适量，加溶剂配制成一定浓度的溶液，然后定量稀释，进样，至信噪比约为3：1。

测定方法2：精密量取定量限测定溶液3ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，进样。

（4）定量限（主成分和订入标准的特定杂质）

定量限是可以准确定量的最低限度，定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量限不得大于该杂质在质量标准中的限度。

测定方法1： 取待测物适量，加溶剂配制成一定浓度的溶液，定量稀释后分别进样，至信噪比约为10：1。

测定方法2：将信噪比为10：1时的样品溶液，连续进样6针，计算峰面积的相对标准偏差。峰面积的RSD≤10% 。

（5）溶液稳定性（一般至少考察8小时）

考察样品在配制溶剂中的杂质与主成分的稳定性。配制供试品溶液，测定条件下放置，分别于0、2、4、6、8、12小时进样。考察项目见下表：

时间（小时） 主峰面积 特定杂质（%） 单个杂质（%） 总杂质（%） 0 2 4 6 8 12 RSD（%） 绝对差值 要求：主峰面积RSD不超过2%；杂质的绝对差值不超过0.1% 。 （6）耐用性试验 （此项最后做）

耐用性试验是指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。一般考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％、三根不同牌子的色谱柱。 举例见下表：

柱温（℃） 30 35（标准） 40 杂质数 （个） 单个杂质 （%） 总杂质 （%） 主峰理论板数 主峰与相邻杂质峰峰分离度 主峰拖尾因子 注：标准条件采用溶液稳定性0小时的结果，均按面积归一化法计算。 可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0；主峰与相邻杂质峰峰分离度应不小于1.5；主峰理论板数应符合要求。杂质含量变化的绝对值在±0.1％以内。

特定杂质的定量方法

有关物质杂质的定量方法根据杂质与主成分的最大吸收波长及校正因子来确定。若杂质与主峰的吸收波长基本一致，则一般采用自身对照法或峰面积归一化法；若杂质与主峰的吸收波长差异范围较小，校正因子在0.9～1.1之间，则可采用不加校正因子的主成分自身对照法；超出该范围，校正因子在0.2～5.0范围以内时，采用主成分自身对照法的定量方式，须用校正因子进行校正；若杂质与主峰的吸收波长相差较大，校正因子在0.2～5.0范围以外时，不能通过校正因子校正，要采用外标法进行测定。

（1）外标法 进样精密度试验

取杂质对照品溶液，连续进样6次，峰面积RSD不大于2%，保留时间RSD不大于1% 。

重复性

配制6份供试品溶液，依法测定，按外标法测定杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差和绝对变化值。

中间精密度

配制6份供试品溶液，依法测定，由不同分析人员、用不同品牌的仪器仪器依法测定，测定结果的精密度。按外标法测定杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差和绝对变化值，并将测定结果与重复性的结果比较。

线性

取杂质对照品，在定量限浓度与限度浓度的150%之间，配制一系列溶液，

至少5份。以峰面积对浓度进行线性回归，线性相关系数r应不小于0.999.

准确度

用回收率试验来验证测定方法的准确度。

向供试品溶液中，加入高浓度的杂质对照品溶液，制备相当于标准限度浓度50%、100%和150%的溶液各3份，按外标法测定杂质的含量，计算回收率。

可接受标准：限度在0.2%以上的，回收率应在95%～105%；限度在0.2%以下的，回收率应在90%～110% 。

（2）加校正因子的主成分自身对照法

采用标准曲线法计算校正因子，杂质对照品的浓度范围要尽可能与主成分的一致。

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