苯酚的生物降解特性研究_丁霞

“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案

丁霞

一、 实验目的

酚类化合物为原生质毒物，毒性较大。焦化、煤气、石油、木材防腐、造纸、合成氨等工业废水中都含有高浓度的苯酚。含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。利用降解菌来控制苯酚的污染，越来越受到人们的重视。本项目拟采用微生物培养、苯酚生物降解的途径及其降解关键酶的分析、微生物DNA的提取、分光光度计测定、PCR、TA克隆等实验技术，阐明苯酚降解菌株的生长特性和苯酚的生物降解特性，苯酚降解菌的系统发育。对学生从事有机污染工业废水的生物处理以及有机污染的土壤或水体的生物原位修复方面的科学研究具有深远的意义。 二、 实验原理

利用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐溶液作为驯化液，对某废水处理厂活性污泥进行驯化培养，从中分离筛选出苯酚降解菌。利用比浊法测定微生物生长量，4-氨基安替比林直接光度法测定苯酚浓度，分析苯酚生物降解的途径及其降解关键酶，PCR扩增细菌的16s RNA进行苯酚降解菌的系统发育分析。 1）微生物生长量的测定方法——比浊法

比浊法是实验室中常用的用来测定微生物生长量的方法，以反映微生物数量或浓度的一种指标。该方法是根据当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度将被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。根据所测得的吸光值，就可以得到微生物的生长量。本实验采用的波长为600nm，使用空白培养基作为对照。 2) 苯酚浓度的测定方法 见后面附录。

3）苯酚降解菌的系统发育分析

16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性。随着PCR技术

的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为微生物检测和鉴定的一种强有力工具。该技术主要有三个步骤：首先，基因组DNA的获得；其次，16S rRNA基因片段的PCR扩增，并进行TA克隆用于测序分析；最后，进行16S rRNA基因序列的系统发育分析。

三、 实验所需仪器设备及台套数、实验用具与消耗品清单及数量 1. 实验设备

分光光度计（6台），PCR仪（2台），双层摇床（3台），恒温培养箱（1台），普通显微镜（3台），超净工作台（2台），灭菌锅（2个），琼脂糖凝胶电泳系统（2套），凝胶成像系统（1台），微波炉（1台），水浴锅（2台），干燥箱（1台），离心机（3台），磁力搅拌器（3台），电子天平（3台）。 四、 实验用具

250ml三角瓶（300个），平板（60），试管（100），移液器（10套），100mL 的分液漏斗（10个），接种环（4支），枪盒、枪头、EP管（若干），酒精灯（10），玻片和载玻片（各3盒）。

五、 消耗品（未注明数量的均为1瓶）

苯酚（5瓶），酵母粉，蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，柠檬酸，氯化铵，氨水，盐酸，氢氧化钠， 4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿（10瓶），饱和酚，异戊醇，无水乙醇（3瓶），氨苄霉素，ITPG，X-gal，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺，Na2HPO4，NaH2PO4， K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，醋酸钠，Tris，HCl，EDTA，结晶紫，番红，碘液，pH试纸，琼脂粉（2瓶），琼脂糖（2瓶），蛋白酶K（2瓶），溶菌酶（2瓶），RNA酶，DNA marker，DNA加样缓冲液（6x），硼酸，TA载体（2盒），Taq酶（4支），dNTP(2支)，引物，感受态细胞（20支），PCR产物回收试剂盒（1盒），琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒（1盒）。

实验一 苯酚浓度的测定方法 （8课时）

方法一 ：

所用溶液 1）苯酚标准液

精确称取 0.1g 苯酚溶于蒸馏水中，移入 1000ml 容量瓶中，稀释至标线，并贮存于密封良好的棕色瓶中。置冰箱内保存，可使用一个月。 2）20%氨性氯化铵缓冲溶液

称取 20.00g 氯化铵溶于浓氨水中，用浓氨水定溶于 100ml， 此缓冲液pH9.8，贮存在具橡皮塞的瓶中，在冰箱内保存备用。 3） 2%（m/V）4-氨基安替比啉溶液

精确称取4-安替比啉 2.00g 溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至100ml，贮存于棕色瓶中，此液应临时配制。 4） 8%（m/V）铁氰化钾溶液

精确称取 8.00g 铁氰化钾溶于蒸馏水中，并定融至100ml，此试剂最好临用时配制。

测定步骤

(1) 标准曲线的绘制

于一组8支50ml比色管中，分别加入0、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、10.00、12.50ml的酚标准液，加水至50ml标线。加0.5ml缓冲液，混匀，此时pH值为10.0左右。加4-氨基安替比啉溶液lml，混匀。再加lml铁氰化钾溶液，充分混匀后，放置10min后，以水为空白，用分光光度计测定OD510值(用光程为20nm比色皿)。经空白校正后，绘制吸光度值对苯酚含量(mg)的标准曲线(图2-1)。

(2) 培养液中苯酚浓度的测定

将分离得到的降酚菌分别接种在苯酚浓度为 500mg/L 的无机盐培养液中，每隔 24 小时测定培养液中苯酚的浓度，最后分析数据，判断每个菌株降解苯酚能力的大小。具体培养液中苯酚测定方法是首先将培养液以1000rpm离心10min，取上清 0.5ml 置于 50ml 的比色管中，加入无酚蒸馏水到 50ml 标线，加入 0.5ml缓冲液混合均匀。加入 1ml 2%的 4-氨基安替比啉，混匀。再加入lm1 8%的铁氰化钾溶液，混匀。10-15min 后，在 510nm 处读取吸光度。若读数过大则进行适当的稀释，使其读数介于 0.2-0.8 之间。根据苯酚标准曲线得出相应的苯酚浓度，起始苯酚浓度与终点苯酚浓度的差反映每株降酚菌株降解苯酚能力的大小。

注意：测量苯酚浓度时，苯酚要根据标准曲线和测试组苯酚的浓度，进行相应稀释，使得OD值在有效区间内。

方法二 4-氨基安替比林直接光度法

（1）原理

4-氨基安替比林直接光度法是测量溶液中酚类浓度常用的方法。苯酚在碱性条件（pH=10±0.2）并有铁氰化钾存在的情况下，能与4-氨基安替比林发生化学反应，生成橙红色的安替比林吲哚酚染料，其水溶液在波长510nm处有最大吸收，利用这一特性，可以测定溶液中苯酚的浓度。 （2）溶液配制

①苯酚标准储备溶液(1.0000g/L ) : 准确称取1.0000g苯酚,用新煮沸并冷却的蒸馏水溶解并定容至1000mL;

②苯酚标准工作溶液(10mg/L) : 移取10. 00mL苯酚标准储备溶液,用新煮沸并冷却的蒸馏水定容至1000mL (临用前配制) ; ③NH3 ?H2O: 取35mL NH3 ?H2O稀释至1000mL;

④K2HPO4 - KH2 PO4 缓冲溶液: 溶解104. 5g K2HPO4 和72. 3g KH2 PO4 于无酚水中,稀释至100mL;

⑤ 4 - 氨基安替比林溶液(每周新配制) : 20g/L; ⑥K3〔Fe (CN) 6 〕溶液: 80g/L; ⑦三氯甲烷。

注：实验所用水均为无酚水,化学试剂为分析纯。 （3）实验方法

准确移取4. 0mL酚标准工作溶液于100mL烧杯中, 加入2. 0mL 0. 5mol/L 的NH3 ?H2O, 稀释至20mL, 用磷酸缓冲溶液调节pH为8. 0。将调好pH值的溶液转入100mL 的分液漏斗中, 加入0.4 mL 4 - 氨基安替比林,混匀; 再加入0.6 mL K3〔Fe (CN) 6 〕溶液充分混匀后, 放置10min。准确加入4. 00mL三氯甲烷进行萃取,闭塞、剧烈振摇2min, 静置分层。将氯仿层放入1cm比色皿,以试剂空白为参比测定其吸光度。 （4）制作苯酚浓度的标准曲线

将标准苯酚溶液稀释成不同浓度，按实验方法，测定吸光值，绘制标准曲线。得曲线如下：

吸光值0.70.60.50.40.30.20.10-0.102468苯酚含量（mg）系列1线性 (系列1)

图2-1苯酚标准曲线

思考题：

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