丝氨酸蛋白酶的相关研究(2)

B.形成乙酰化酶中间物

四面体结构在His57N（3）质子供体作用下（酸碱催化）分解，形成酰化酶中间物，R′NH2从酶分子上释放并由溶剂H2O替代。这一过程极不稳定，但人们还是分离得到了弹性蛋白酶的酰化酶中间物（-55℃条件下），并进行了X射线结构的研究。 C.脱酰过程

脱酰反应是酰化反应的逆过程，释放生产物羧酸，酶得以再生。在这一过程中，H2O为亲核试剂。

2.5.2 丝氨酸蛋白酶作用机制验证

上述胰凝乳蛋白酶作用模型经很多实验证明是合理的。下面列举一些成功的实验证据。 A.四面体中间物存在的实验依据

Robert Huber 对胰酶和牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）复合物的X射线研究结果是四面体中间物存在的有力证明。BPTI是具有58个氨基酸残基的蛋白质，与胰蛋白酶结合时，因形成复杂的氢键网络而使酶失活。这个复合物的结合常数高达1013（mol/L）-1，是已知的蛋白质之间最强的相互作用。

B.丝氨酸蛋白酶优先于过渡态底物结合

一些丝氨酸蛋白酶与抑制剂结合的复合物，它们的结构经X射线仔细研究、比较，使人们搞清了这些酶作用的结构基础。

(1) 随着四面体中间物形成而产生的构象变化导致了被水解肽键的羰基氧更加靠近活性中心部位，以利于占据称为氧阴离子洞的（Oxyaninon Hole）空穴。

(2) 在此空穴中，酶与羰基氧形成两个氢键，而在正常的结构中不存在这种氢键。

(3) 四面体形变结果，使在水解肽键前，酶与胎骨架上—NH—形成近似氢键，因而酶容易同四面体中间物结合。

这些现象解释了丝氨酸蛋白酶的高催化效率。事实上，由于DIPF四面体结构是过渡态类似物，因而是丝氨酸蛋白酶有效的抑制剂。 C.催化三元组的功能

早期的文献认为Asp102极化了His57，使其直接从Ser195吸取质子，而使Ser195成为有效的亲核攻击试剂（羟基）。事实上，用对硝基苯磺酸甲酯处理胰凝乳蛋白酶，使His57专一性地甲基化，以阻断催化三元组的作用。

然而，产生的酶仍有较好的催化活性，比非酶催化的反应加速2×106倍（天然酶约1010倍）。很明显，催化三元组的功能很大程度上是作为质子供体和质子吸收器（酸碱催化），胰凝乳蛋白酶速度增加的主要因素恐怕主要来源于与反应的过渡态优先结合。 3 酶工程(酶的抑制剂设计)

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）是一类拥有超过500个成员的蛋白酶超家族，其三级结构高度保守，在食物消化、补体激活、血液凝固等生理过程中起重要作用。 3.1 体内凝血过程中丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用

以凝血过程为例，正常生理条件下，由于存在体内凝血系统，伤口处血液流失可以很快被形成的血纤维蛋白凝块中止。但凝血系统异常会导致一系列疾病，如冠状动脉血栓的形成会导致心肌梗塞等。由于血液凝固的级联放大过程中凝血酶位于中心地位，其抑制剂的研究时早起抗血栓药研制的重点。肝素是常用的抗凝血药物，但有时会引起血小板减少和出血症。因此，人们把注意力转向研制凝血酶的抑制剂，但直接抑制凝血酶能再临床上导致出血并发症，尤其与抗血栓药物TPA等合用时后果更严重。此外，凝血酶的抑制剂并不能阻止循环系统中大量的凝血酶原转化为凝血酶。与传统药物肝素等相比，催化凝血酶原转化为凝血酶的活性Xa因子的抑制剂专一性高，副作用小，更为安全有效。

3.2 Xa因子的抑制剂

Xa因子是一种类似于胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶（a表示活化的意思，activatied），在钙离子和V因子存在下，Xa因子和凝血酶原复合物粘附到血小板的带负电荷的磷脂表面，随后凝血酶原被活化。Xa因子切割底物凝血酶原各种底物和抑制剂。天然存在的Xa因子抑制剂有墨西哥水蛭中提取的119个氨基酸组成的多肽ATS（Antistasin），60个氨基酸组成的壁蚤抗凝固胎TAP（Tick Anticoagulant Peptide）和水蛭唾液中提取的由133个氨基酸组成的多肽Yagin。这些抗血栓药物都已实现了DNA重组表达。 3.3 组合胎库法

人工设计的小分子抑制剂至少有几十多种，都死基于敏感键两端Gly-Arg（P2-P1）氨基酸的结构特征进行构建并加以优化合成了各种系列抑制剂。这种基于酶作用机理研究的药物设计是一种非常有效的方法，为了快速寻找和高通量的筛选新的小分子抑制剂，组合肽库是一种很好的方法。该方法的原理基于20世纪60年代提出的多肽固相合成法，以三个配体合成为例，用仅仅三个配体和三部反应就可产生27种化合物，每一种不需分离就可进行检测，一旦检测到有药物活性的“起始化合物”，就可用化学方法优化这种物质的结构，使其性质适合于药物。

通过筛选D-氨基酸、L-氨基酸、环状的D-氨基酸、L-氨基酸肽库，最后在L-氨基酸肽库中找到了Xa因子的多肽抑制剂，其N端的序列特征为L-Tyr/Phe-Ile-Arg，并对Xa因子的底物表现出竞争性抑制。对Xa因子具有抑制性的戊肽，简称SEL1691进行缺失研究发现，C末端去除1-3个残基对SEL1691抑制活性影响较小，但N末端去除Ala会灭火戊肽的抑制活性。一些非天然的氨基酸如吡啶丙氨酸，甲基苯磺酰甘氨酸等可以替代Tyr，Ile基本不可置换，但环己基甘氨酸替换Ile得到的SEL2316却使抑制活性提高了60倍。N末端分别对氨基苯丙氨酸和环己基甘氨酸形成的SEL2489活性不变，但半衰期较长，进一步用Arg的类似物甲基-吡啶-丙氨酸代替Arg得到的SEL2711稳定性更好。

化学和生物科学的迅速发展使传统的寻找药物的方法发生了根本性的变革，对于天然产物的筛选曾经是药物化学家关注的焦点。传统的样品筛选首先需分离纯化，测试所需的量也较大，而现在筛选多用生物学检测方法，不需要对混合物进行分离，只有测得有生物活性时才需要进行药物提取，且微量样品足以进行活性测定。传统的药物化学家一年可合成数百个样品供药物筛选，这些样品如今通过自动分析仪一天就可完成活性检测，这种快速筛选法反过来对于样品的提供带来了极大的压力。因此，类似于肽库合成的化学组合合成法可提供为数众多的样品供药物筛选，

由此可见，传统的药物设计方法与组合库的方法互为补充，将筛选到的新的化合物进行结构修饰、优化，现已成为药物研究的新的方向。 4 酶应用

随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造、酶反应器等酶技术的不断发展，酶应用的范围亦在不断地扩大，主要是在医药、食品、纺织以及日用化学工业方面，另外在环境保护以及能源开发及生物工程、化学分析以及生物传感器等方面也有重要应用[5]。酶的应用是酶工程的重要内容之一。

丝氨酸蛋白酶在心血管疾病医治方面有广泛的应用。由纳豆芽孢杆菌产生的具有纤溶性的丝氨酸蛋白酶-纳豆激酶，可经口服直接作用于交联纤维蛋白，同时增加内源性纤溶酶的活性。从蚯蚓身上提取的蚯蚓纤溶酶具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有类尿激酶的纤溶酶原激活活性，因此既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成。蛇毒丝氨酸蛋白酶属于糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，大多数 能对凝血/纤溶系统起作用。TSV-PV是非常专一的蛇毒纤溶酶原激活剂，对生理性丝氨酸蛋白酶抑制剂有很强的耐受性。

丝氨酸蛋白酶在真菌基础性研究中也有应用。致病性真菌在体外或感染宿主过程中能够分泌内源性和外源性胞外蛋白酶，已引起广泛关注。利用菌株细胞芯片技术结合免疫组化方法可以检测各型新生隐球菌菌株细胞中丝氨酸蛋白酶的表达分布情况，横向对比丝氨酸蛋白酶在新生隐球菌致病过程中的作用。

丝氨酸蛋白酶作为一类重要的水解酶，人们对其结构、功能及重组表达的研究已经很深入，并且已经有不少种类的丝氨酸蛋白酶被应用到医药等领域。在这些研究成果的基础上，人们可以通过丝氨酸蛋白酶基因的克隆、重组、表达以及蛋白互作等方面的研究为丝氨酸蛋白酶的应用提供新的思路。

参考文献：

[1] 汪世华,王文勇,黄益洲,林琳,沙莉.丝氨酸蛋白酶研究进展[J].福建农业学报.2007,229(4):453-456. [2] 何智,陈政良.补体系统丝氨酸蛋白酶的结构与功能[J].国外医学免疫学分册,2004,27(6):316-319.

[3] MAXWELL.M.K. ENRICO. D C. Molecular Markers of serine Protease evolution [J].Embo Journal. 2001,20(12), 3036-3045.

[4] 袁勤生,赵健.酶与酶工程[M].华东理工大学出版社,2005:91-102. [5] 肖连东,张彩莹.酶工程[M].化学工业出版社,2008,191-192.

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