有毒有害物质检测

第六章 兽药残留检测技术 第一节 兽药残留

兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。 兽药最高残留限量（MRL）：是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位μg/kg, 以鲜重计）。

休药期：是指自末次给药到动物允许屠宰或其动物性产品（乳、蛋等）获准上市的间隔时间。 兽药的危害：过敏、致畸、致突变、致癌 一、常见兽药

主要有：抗微生物药(抗生素、抗菌药和抗病毒药)、抗寄生虫药(抗蠕虫药、抗原虫药、杀虫药)、激素类及生长促进剂等。

1、抗微生物药是指对病原微生物(细菌、真菌、支原体、病毒等)具抑制或杀灭作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺药及其他化学合成抗菌药。

2、抗寄生虫药是指能杀灭或驱除动物体内外寄生虫的药物。 3、激素与其他生长促进剂

(1)性激素 (2)生长激素 (3)甲状腺素 (4)人工合成的蛋白质同化激素 (5)镇静剂和β-肾上腺素阻断剂 二、常见兽药残留的种类与危害 1. 抗生素类药物

青霉素类最容易引发超敏反应, 四环素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏、极度超敏反应损害听力及肾脏功能。 2. 磺胺类药物

主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺眯, 菌得清、新诺明等。 引起结晶尿、血尿、管型尿、尿痛、尿少甚至尿闭。 3. 硝基呋喃类药物

主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。

对人造成的危害是胃肠反应和超敏反应，长期摄入可引起不可逆性末端神经损害。 4. 抗寄生虫类药物

主要用于驱虫或杀虫, 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。

对人主要的潜在危害是其致畸作用和致突变作用。对于妊娠期的孕妇有可能发生胎儿畸形，对所有消费者来说, 可能由于其致突变作用使消费者发生癌变和性染色体畸变, 从而其后代有发生畸形的危险。 5. 激素类药物

主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度, 使用于动物的激素有性激素和皮质激素。而以性激素最常用, 如孕酮、睾酮、雌二醇、甲基睾酮, 丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。

摄入性激素残留超标的动物性食品, 可能会影响消费者的正常生理机能, 并具有一定的致癌性, 可能导致儿童早熟、儿童发育异常、儿童异性趋向等。 二、食物中兽药残留（重点掌握） (1)兽药残留的来源

①不正确地应用药物,如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示,这些因素有可能延长药物残留在体内的时间,从而需要增加休药的天数; ②在休药期结束前屠宰动物;

③屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检查; ④ 以未经批准药物作为添加剂饲喂动物;

⑤药物标签上的用法指示不当,造成违章残留物;

⑥饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料;

⑦接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的废水和排放的污水(如猪经常摄入这种污水);

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⑧任意以抗生素药渣喂猪或其他食品动物等滥用抗生素,是出现抗生素残留的主要原因。 (2)兽药残留的种类（掌握）

第一类是以游离或结合形式存在的原药及其主要代谢物。,因代谢和排泄迅速,不会在动物体内蓄积。但这些物质可能具有毒性作用,而且被人摄入后在体内可生成高度活化的中间产物,，因而对消费者具有潜在的危害性。

第二类是共价结合代谢物,因其从机体排出相对较慢,它们的存在对于靶动物有潜在的毒性作用,而对于消费者,由于结合残留在人体内不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只显示很低的毒性。 三、兽药残留的危害——五点

动物性食品中的兽药残留对人体健康的影响,主要表现为①变态反应与过敏反应、②细菌耐药性、③致畸作用、致突变作用和致癌作用,④激素(样)作用、⑤一般毒性作用等多方面。

细菌耐药性是指有些细菌菌株对通常能抑制其生长繁殖的某种浓度的抗菌药物产生了耐受性。 第二节 样品前处理

1、样品前处理是指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。

2、残留分析中的样品主要是各种食用组织(肌肉、脂肪、肝、肾、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)。 3、活体检测中一般采集血浆、尿液和粪便;屠宰场主要采集某种药物的靶组织及其他高浓度的样本,如肝、肾、胆汁、注射部位的组织等。

4、食品样品前处理

食品分析中样品前处理,包括了抽样、制备和提纯。 一、生物样品的类型（必须掌握）

兽药残留分析中,最常用的生物样品是组织样品,其次是奶、血液和尿液样品。 (1)动物组织

肝或肾组织为代谢或排泄器官,残留物浓度高,消除缓慢,因此常被作为残留检测的靶组织。 (2)尿样

尿液的主要成分是水、尿素及盐类。它是一种良好的细菌培养基,因而需立即冷藏或防腐处理。

若欲在室温下保存,应在收集尿样后,立即加入防腐剂。在所有体液样品中,尿样最容易获得,并且样品量多,内含药物(母体药物及代谢物)浓度高;正常尿液中仅含微量蛋白质,不需去蛋白处理。

尿中药物大多呈结合状态,主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在,因此无论直接测定或萃取分离之前,都必须将结合态的药物水解,使药物游离出来。

尿样pH变化范围大,分析前需调节到一致的pH值。 (3)血样

1、血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白,血液逐渐凝固,上层析出澄清的黄色液体称为血清。

2、若采血后立即将血液转入有抗凝剂(常用肝素)的容器中,并轻轻摇匀,则血液不再凝结,放置后血细胞会缓缓沉降,1~2h沉降完全,上层的黄色液体称为血浆。

3、若抗凝血不离心,保持血浆和血细胞混合在一起,则称为全血。

4、血浆和血清的化学成分与组织液相近,测定血浆或血清中药物浓度,比全血更能反映作用部位药浓的变化,测定方法一般也可互相通用。 ⑷奶样

非解离性的或极性较低的药物易由血浆向奶中扩散,导致奶中残留。 与血浆样品类似,奶中的药物可与蛋白质结合。 因此在萃取之前,必须将结合态的药物游离出来。 ⑸蛋

禽蛋包括蛋黄和蛋清。与蛋清相比较,蛋黄基本上为疏水性环境,低极性药物的残留较多。

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二、去蛋白处理

1、为什么要除去蛋白？？

因为生物样品含有大量的蛋白质,蛋白质在测定过程中会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定。蛋白质还会污染仪器或恶化测定条件,如直接进样用液相色谱分析含蛋白质的体液样品时,蛋白质会沉积在色谱柱上,这不仅影响柱效,而且大大缩短色谱柱的使用寿命。 2、方法（掌握）五点 1、有机溶剂沉淀

甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂,尤以甲醇和乙腈为最常用。 2、酸性沉淀

常用的酸性沉淀剂有三氯醋酸和高氯酸,其他还有钨酸、钼酸、磷钨酸、磷钼酸和苦味酸等。

酸性沉淀剂能同蛋白质的阳离子形成不溶盐而沉淀,必要条件是溶液的pH要低于蛋白的等电点。 3、无机盐沉淀

无机盐中以硫酸铵最常用。常用的重金属盐类有汞盐、铜盐和锌盐等,它们能与蛋白质形成不溶盐而沉淀析出。 4、透析法

透析法与超滤法也是除去样品中蛋白的方法。很费时,溶质透过膜的程度与被测物的性质、温度有关,膜需常常更新,很难自动化,因此透析法一般不用于常规分析。 5、超滤法

① 与蛋白沉淀法相比,其优点是适用于小量样品,不稀释试样,也不改变试样的pH,尤其适于含对酸碱不稳定的化合物的样品,用于样品的浓缩、脱盐、不同分子尺寸的分离。

② 如果待测物易被某种酶分解,那么超滤除去该酶后就避免了待测物的分解。在残留分析中超滤法常用于牛奶、血液中游离药物浓度和药物-血浆蛋白结合率的测定。

③ 超滤法的缺点是待测物可能被结合在滤膜上而影响回收率,而且一些能与大分子蛋白结合的药物也会随着蛋白质被除去而丢失。 三、结合物水解 (1)酸水解

酸水解通常使用无机酸,如尿样中结合物水解可加入适量的盐酸液。加入盐酸的浓度、酸化时间以及是否需要加热等,随药物而异,但最终应通过实验确定。水解后的样品呈强酸性,必要时可用碱液调整pH后再进行萃取。 (2)酶水解

1、是专一性很强的水解结合物的方法。通常使用的水解酶是β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专门水解药物的葡萄糖醛酸苷,后者水解药物的硫酸酯。也可用两者的混合物,将生物样品中药物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同时水解。

2、优点：与酸水解相比,酶水解反应比较温和,一般不会引起被测药物分解；

3、缺点：酶试剂较贵、水解所需时间较长,使实验费用增加,此外酶试剂还会带入黏液蛋白等杂质,可能导致样品乳化或造成色谱柱阻塞。 (3)溶剂解

某些药物或内源化合物的硫酸酯,可随加入的萃取溶剂,在萃取过程中发生分解,通常称为溶剂解。也是分解结合物较温和的一种方法。 四、样品提取和净化

1、液-液萃取——是目前最常用的样品处理方法,其原因是:

①通过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来,减少杂质对测定的干扰; ②操作简单快速、经济实用; ③可将萃取液蒸发,使组分富集; ④可一次进行同类组分的萃取。

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溶剂选择应注意以下几点:①溶剂的极性②溶剂的沸点③溶剂的毒性④溶剂与水的互溶性——一般有机相与水相容积比以1:1或2:1为佳 2、固相萃取(SPE)

固相分离有两种实现样品纯化的途径。一种是保留杂质,待测组分不被保留而自然流出或者被洗脱;更为常用的一种途径是先使待测物完全保留在柱上,使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出,然后以小体积溶剂洗脱待测物。

优点：①快速,一般l~2min即可完成; ②回收率高,通常超过90%; ③精密度比较好;

④样品用量少,有一定的选择性,无乳化现象等。 3、基质固相分散技术（MSPD） 1、优点在于：

依靠机械剪切力、C18键合相的去垢效应和巨大的表面积，使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失，而且固定相处理样品的比容量大，提取净化的效率较高。

2、MSPD处理样品耗时短、节省溶剂、样品用量少，该方法已被用于近40种的兽药残留分析。 4、柱切换技术 优点：

①操作简单，全自动化，含蛋白样品可直接进样或简单地沉淀蛋白离心后即可进样；

②分析结果精密度高，一般无需内标，进样体积一般为0.2~1.0mL（血浆、血清因黏度较大，需稀释后进样），在线处理全过程由计算机程序控制，每个样品在同一预柱的相同条件下处理，分析结果的RSD一般小于5%。

③适于不稳定样品，如易光解、热不稳定样品的分析，全部过程在封闭状态下进行，避免了分离、浓缩等操作；

④富集作用，提高了检测灵敏度，尤其是极性较大的组分，无法用液-液萃取时，柱切换技术特别奏效。 5、超临界流体萃取（SFE）

既能溶解各种气体不溶解的物质,又有气体黏度小、渗透力强等优点,可以快速、高效地将被测物从样品中萃取出来。

6、固相微萃取（SPME） 7、免疫亲和色谱IAC 第三节 样品衍生化技术

一：衍生化是将样品中的待测组分制成衍生物,使其更适合于特定的分析方法。 (1)柱前衍生化

1、柱前衍生化是在色谱分离前,预先将样品制成适当的衍生物,然后进行分离和检测。

2、优点：衍生化试剂、反应时间和反应条件的选择都不受色谱条件的限制,衍生化后的样品能用各种预处理方法进行纯化和浓缩,也不需要附加特殊的仪器设备。

3、缺点：操作比较繁杂费时,容易引起误差,影响测定的准确度。 (2)柱后衍生化

1、柱后衍生化是样品经色谱分离后,使衍生化试剂与色谱流出组分在系统内进行反应,然后检测衍生物。 2、优点：操作简便、重复性好,色谱分离相衍生化连续自动进行,而且衍生化不影响组分的色谱分离。

3、缺点：需要附加输液泵、混合室和反应器等装置,由于柱出口至检测器间有较长的流程,可能发生色谱峰展宽。

实现柱后衍生化必须满足下列条件：

①衍生化试剂足够稳定,对检测器的响应可以忽略,不产生干扰;

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②衍生化试剂溶液与色谱流动相能互相混溶,混合后不产生沉淀或分层,而且色谱流动相适宜作衍生化反应的介质;

③衍生化试剂与色谱柱流出液的速度要匹配,混合迅速且均匀,以免产生噪声; ④衍生化反应必须迅速和重现性好,反应器设计要合理,以尽可能减少峰展宽。

第四节 抗生素类药物残留的危害分析与检测方法 一、氨基糖苷类抗生素

1、化学结构：由于其分子结构中都有一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子,由配糖键相连接,因此最好称为氨基糖苷-氨基环醇类(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素,但因氨基糖苷类抗生素这一名称沿用已久

2、危害：该类药物的治疗浓度范围窄,不良反应较常见,主要为肾毒性、耳毒性、神经肌肉阻滞、造血系统毒性反应和过敏性反应,其中有些是不可逆毒性。

3、生物样品预处理：样品的预处理包括脱脂除蛋白、提取、净化和样品浓缩。 ①除蛋白的方法：

一是沉淀法,即在样品溶液中加入甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。

二是酸提取法,即在样品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质,将生物样品与酸溶液混匀或一起均质。某些情况下,如测定肾脏中阿布拉霉素,还需用浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解,保证有较好的样品回收率。蛋白水解包括酸解法或碱解法,上清液再经中和。 三是超滤法,经超滤法处理后的样品不会引入新的盐类污染及假色谱峰。

四是固相萃取法,这是近年来在残留分析中应用最广的一种快速、简便的除蛋白方法。 ①、提取

用高或低的pH值介质可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。

酸性介质：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-柠檬酸或甲醇-高氯酸溶液与样品一起均质、提取。 碱性介质：如甲醇-氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布拉霉素 ②、净化

净化方法包括液-液分配、固相萃取和基质固相分散技术(MSD)、在线痕量富集法等。

唯一例外的是阿布拉霉素,在辛烷磺酸离子对试剂介质中,可以用乙酸乙酯进行提取,提取回收率约90%。 4、分析方法

①、气相色谱法：样品脱蛋白和脱水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步衍生化,然后用电子捕获检测器（ECD）检测。

②、液相色谱法：氨基糖苷类药物可采用阳离子交换色谱柱或非极性反相色谱柱分离。检测器：紫外或荧光衍生化

二、四环素类 （一）样品处理

四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团:二甲胺基[-N(CH3)2]、酰氨基(- CONH2)、酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统。

本类抗生素是两性化合物,分子中存在酚羟基和烯醇型羟基,显弱酸性;同时含有二甲胺基,显弱碱性,故遇酸及碱,均能生成相应的盐。

1、提取：从生物样品中分离四环素类比较复杂,因为这类药物易与金属离子形成螯合物,以及与组织中的蛋白强烈结合,因此须用强酸或酸性脱蛋白剂进行提取。

2、净化：包括液-液萃取、固相萃取(SPE)、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等方法。 （1）液-液萃取：

四环素类药物不溶于二氯甲烷等疏水性有机溶剂,因此液-液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质洗去。

（2）固相萃取(SPE)

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