年产1000T碱性蛋白酶生产车间设计(2)

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性质的进一步分析研究，可为国内应用行业的科研人员提供一种新的蛋白酶品种，推动酶制剂应用技术的快速发展。

近十年来，酶制剂产业已经成为生物工程的重要组成部分，它的发展非常迅速，仅1998年全世界工业酶制剂销售额高达16亿美元，预计到2012年，销售额将达到40亿美元。酶制剂对我国的国民经济发展起着非常重要的作用，是我国化学工业―十五‖和―十一五‖规划中加快发展的精细化工产品，酶制剂工业作为高技术产业，是21世纪最有希望的新兴产业之一。

酶制剂是一类具有生物催化能力的蛋白质，它以用量少、催化效率高、专一性强的特点，在生物技术应用领域备受瞩目。目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶种中应用得最多的一种酶，约占酶总量的60％，其中碱性蛋白酶就占25％。碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究最为广泛和深入。碱性蛋白酶在改善人民生活质量、降低劳动强度、节约原料和能源、保护环境等方面发挥着重要作用，并产生巨大的经济效益和社会效益。在高技术日新月异的今天，碱性蛋白酶在日用化工、食品、环保、医药及一些新兴产业中更是具有巨大的市场潜力，发展前景极其广阔，大力开发碱性蛋白酶的应用基础研究及生产研究势在必行。 2碱性蛋白酶的基本性质和生产工艺的选择 2.1碱性蛋白酶的基本性质 2.1.1碱性蛋白酶的概念

碱性蛋白酶是经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术，广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。 2.1.2碱性蛋白酶的特点

碱性蛋白酶是由芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。

碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢，具有独特的洗涤效果。碱性蛋白酶在技术上采用细菌原生质体诱变处理方法，从国内碱性蛋白菌生产菌2709枯草杆菌中研究选育出若干稳定高性能菌株，在后处理上，采用去渣盐析沉淀法，减少了蛋白酶的杂质含量和产品特有的气味，提高了溶解速度，与洗涤剂有更好的配伍性，延长了保质期。

碱性蛋白酶作为水解大豆分离蛋白的酶源，确定水解条件及制备多肽的工艺用于碱性蛋白酶制备多肽，从而达到理想的效果[8]。大豆从古至今被认为是―营养的宝库‖， 在日本关于大豆的研究已经十分深入。从脱脂大豆到原油，从医用到食用所涉及的领域十分广泛，产品品种繁多，其中大豆多肽的研究成

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为了近年来的热点。多肽是由蛋白质中20 种天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的，从二肽到复杂的线性或环形结构的不同肽类的总称，其中可调节生物生理功能的多肽称为功能肽。 2.2 培养基主要成分和生产方法

2.2.1培养基主要成分是淀粉2%(M / V)， 麸皮5%(M / V)，玉米浆3%(M / V)，接种量5%(V/V)，溶氧0.03-0.04MPa，吐温-80 0.02%(M / V)，MgSO4 0.02%。 2.2.2 碱性蛋白酶的主要生产方法

1. 直接提取法：从动物器官中提取碱性蛋白酶，然后进行分离纯化。 2. 微生物发酵法：培养有产量高的碱性蛋白酶产生菌，目前主要有固态发酵

法和液态发酵法。诺维信和庞博等生物技术公司普遍采用液态发酵法生产碱性蛋白酶。 2.3生产工艺的选择

上述几种方法中，直接提取法操作简单，但是对原料要求高，并且所得酶制品比活力很低，提取过程中极易降低酶活力，不适合工业化生产。目前主要利用微生物发酵法生产碱性蛋白酶，其液态发酵法产酶率较高，并且耗能少，且简便了下游工作的分离提纯；而固态发酵法产酶周期长，酶比活力较低，产酶量少，加大了下一步分离提纯的难度。

综上所述，采用液态发酵工艺是可行的，而且是目前国内外碱性蛋白酶生产的主要生产方法，所以在本次设计采用的工艺是液态发酵法。 2.3.1工艺原理

邱秀宝[8]采集38个不同土样， 从中筛选到一株产碱性蛋白酶的嗜碱性短小芽孢杆菌R115 ， 经NTG和利福平处理， 获得一株具有高产稳产的碱性蛋白酶变异株B45。徐子渊[9]等将碱性蛋白酶生产菌2709进行诱变育种， 获得变异株C1213 ， 酶产量提高了40%。郑铁曾[10]等对如何提高C1213碱性蛋白酶活力进行了研究， 通过优化设计， 酶活力达到21 000 U /mL， 相对原始菌株2709酶活提高了170%。冯清平[11]等也从土样中筛选到一株产碱性蛋白酶的嗜碱性地衣芽孢杆菌53 - A6 ， 对其原生质体进行复合诱变处理， 从中选育出了耐高温、耐碱的碱性蛋白酶高产株。在生物技术领域中， 碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过姚刚等人对培养基成分及培养条件进行优化，得出最佳的发酵培养基成分为：酵母浸粉2%、蔗糖1.0%、吐温-80 0.5%、硫酸镁0.02%；发酵条件为：接种量4%(V/V)、起始pH9，在150ml 的三角瓶中，装液量为25ml，发酵36h。在最佳培养条件下，碱性蛋白酶粗酶活力可达1670U/ml[12]。 2.3.2工艺流程图

液态发酵法生产碱性蛋白酶的工艺流程，包括原料预处理、液态发酵工序、双水相萃取和冷冻干燥工艺三大部分。本次设计的主体是原料预处理、液态发酵工序，生产碱性蛋白酶的基本工艺流程如图1所示。

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图1 碱性蛋白酶工艺流程图

2.3.3 工艺流程说明

首先培养基经过预处理进行灭菌、均质，待温度降到37℃。将培养基分别加入到种子罐和发酵罐内进行发酵，通风搅拌24h。放罐后直接对发酵液进行双水相萃取，经过两次萃取后获得纯的酶液，最后对酶液进行冷冻干燥，便制得产品。

2.3.4分离纯化流程 1. 双水相萃取

萃取原理:将亲水性聚合物加入水中会形成两相。聚合物以不同的比例分配与这两相中，而水分在每一相中都会占很大的比例(85%-95%)，生物蛋白质等在这种体系中能够保持自然活性。

当两种聚合物的水溶液相互混合时，究竟是分层成两相，还是混合成一相，取决于两种因素，一是混合熵的变化，二是分子间的作用力。对大分子而言，则分子间的作用力占主导地位，也就是说，由分子间的作用力决定混合的结果。

若两种聚合物的分子间存在斥力，那么再某一分子的周围就可能系同种分子而非异种分子。当达到平衡后则分成两相，两种聚合物分别进入到每一相中，达到分离的目的。反过来，如果两种聚合物之间存在引力，如在带相反电荷的

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两种聚合物电解质之间，则它们相互结合而存在于同一相中，若两种聚合物间不存在分子间力，则它们相互混合。根据上述分析可知，能够进行双水相萃取的必要条件是：形成的两种聚合物分子间存在引力。

双水相萃取中，影响分配的主要参数有聚合物的分子质量和浓度、pH、盐的种类和浓度、操作稳定等。聚合物分子质量低时，生物大分子易分配于富含该聚合物的相中，当远离临界点时，双水相萃取本身受温度的影响很小。大规模生产总是在常温下操作，一则节省制冷费用，再则聚合物在常温下对蛋白质有稳定作用，不会引起损失，同时温度高时，粘度低，有利于相的分离操作。因此，确定适宜的操作条件，可达到较高的分配系数和选择性。双水相萃取的一个重要优点是可直接从细胞破碎浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，一步操作可达到固液分离和纯化两个目的。

双水相萃取方法： 双水相萃取法的一个主要应用是胞内酶的提取，采用双水相系统可使欲提取的酶与细胞碎片以较大的分配系数分配在不同的相中，进而采用离心法就可实现分离。采用双水相萃取时，通常将蛋白质分配在上相(PEG)，细胞碎片分配在下相(盐)。反过来对相的分离不利，因为当上相固含量髙时，分离机的性能会受到影响。在操作时，单位重量相系统中料浆的加入量是一个重要参数。显然，料浆的加入量愈多愈经济，但过量的料浆会影响原来聚合物的成相系统，是分配系数降低，结果收率降低。根据经验，一般每1kg萃取系统处理200-400湿菌体为宜。 2. 冷冻干燥

冷冻干燥原理：冷冻干燥是将湿物料在较低温度下冻结成固态，然后在高度真空(130Pa-0.1MPa)下，将其中固态水分直接升华为气态而除去的干燥过程，也称为升华干燥。冷冻干燥也是真空干燥的一种特例。

冷动干燥也可将湿物料不预冻，而是利用高度真空时水分汽化吸热而将物料自行冻结。这种冻结能量消耗小，但对液体物料易产生泡沫或飞溅现象而遭致损失，同时也不易获得多孔性的均匀干燥物。冷冻干燥中升华温度一般为-35℃--5℃，而抽出的水分可在冷凝器上冷冻聚集或直接为真空泵排出。若升华时需要的热量直接由所干燥的物料供给，这种情况下，物料温度减低很快，以至于冰的蒸汽压很低而使升华速率降低。一般情况下，热量由加热介质通过干燥室的间壁供给，因此，既要供给湿物料的热量以保证一定的干燥数率，又要避免冰的融化。

与其他干燥相比，冷冻干燥具有以下特点：

1) 干燥温度低，特别适合于高热敏性物料的干燥，生物制品的干燥。又系在

真空下操作，氧气极少，物料中易氧化物质得到了保护，因此，制品中的有效物质及营养成分损失很少。

2) 能保持原物料的外观形状。物料在升华脱水前先进行预冻，形成稳定的固

体骨架。干燥后体积形状基本不变，不失原有的固体结构，无干缩现象。

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3) 冻干制品具有多孔结构，因而有理想的速溶性和快速复水性。干燥过程中，

物料中溶于水的溶质就地析出，避免了一般干燥方法中因物料水分向表面转移而将无机盐和其他有效成分带到物料表面，产生表面硬化现象。 4) 冷冻干燥脱水彻底(一般低于2%-5%)，质量轻，产品保存期长，若采用真

空密封包装，常温下即可运输、保存，十分简便。

但冷冻干燥需要昂贵的专用设备，干燥周期长，能耗较大，产量小，加工成本高。

冷冻干燥流程：冷冻干燥过程分为两个阶段，第一阶段，在低于熔点的温度下，使物料中的固态水分直接升华，大约有98%-99%的水分在这一阶段除去。第二阶段中，将物料温度逐渐升高甚至高于室温，使水分汽化除去，此时水分可以减少到0.5%。冷东干燥系统主要有4部分组成，即冷冻装置、真空装置、水汽去除装置和加热部分，用于生物制品的了扭动干燥流程见带控制点饿工艺流程图。预冷冻和干燥均在一个箱内完成。带干燥的物料放入干燥室内，开动预冷用冷冻机对物料进行冷冻，随之开启冷凝器和真空装置，实现升华干燥操作。加热器以作冷凝器内化霜之用。第一阶段升华干燥结束后，开启油加热循环泵对干燥室加热升温，使之汽化排除剩余的水分。

3初始设计条件与基本物性数据 3.1 碱性蛋白酶发酵工艺技术指标

指标名称 单位 指标数 生产规模 t/a 1000 生产方法 深成液态发酵 年生产天数 d/a 300 产品日产量 t/a 3.4 产品质量 比活力（U/g） 50万 倒罐率 % 1.0 发酵周期 h 36 发酵液酶活力 U/ml 18000 碱性蛋白酶提取率 % 85 冷冻干燥酶收率 % 80 平均总收率率 % 68

3.2 工艺参数与基本物性数据的选取 3.2.1 工艺参数

碱性蛋白酶比活力比活力为50万U/g，生产周期为36h，发酵温度为37℃，溶氧为0.03-0.04MPa。 3.2.2基本物性数据的选取

在低温下油或油脂的平均热容在2.05-2.51kJ/(kg·℃)，随着温度升高比热将增加。 4物料衡算

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