微生物学实验讲义(2)

自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。 7． 镜检

涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。

图1－2 简单染色无菌操作及涂片、干燥和热固定过程

图片说明：1.取接种环；2.将接种环放在酒精灯上灼烧；3.摇匀菌液；4.灼烧试管口；5a5b.取菌液或从斜面上取菌苔；6取菌完毕，再烧试管口，塞上棉塞；7a7b.涂片，从斜面上取的菌与载玻片的水滴混匀后涂片；8.涂片完毕，灼烧接种环；9.固定；10.染色；11.水洗；12.吸干

（五）实验报告内容

根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。

（六）思考题

1. 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？

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3. 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？

三、革兰氏染色法

（一）目的要求

学习并初步掌握革兰氏染色法。

了解革兰染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

（二）基本原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christsin Gram氏创立，而后一些学者在此基础上作了些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如蕃红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同的。革培养氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色。

另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；pH很低时，则可都呈负反应。

革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。

（三）实验材料

1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。 2．染色剂：革兰氏染色液。 3．仪器或其他用具同实验一。

（四）实验步骤

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1．制片

取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。 性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2．初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2 min,水洗。 3．媒染

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 4．脱色

用吸水纸吸去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 5．复染

用蕃红液复染约2 min，水洗。 6．镜检

干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。 7．混合涂片染色

按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。

（五）实验报告内容

列表简述2株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。

（六）思考题

1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应，你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 3．你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。

4．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？

5．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？

6．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？

要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳

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图1－3 革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌染色效果

四、细菌的芽孢染色

（一）目的要求

学习并掌握芽孢染色法。 初步了解芽孢杆菌的形态特征。

（二）基本原理

芽孢又叫内生孢子（endospore）是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置以及芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和

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芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椰圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。

芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱， 当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

（三）实验材料 1．菌种

枯草芽孢杆菌的斜面培养物。 2．染色剂

5%孔雀绿溶液，0.5%蕃红水溶液。 3．仪器或其它用具

小试管，滴管，烧杯试管架，载玻片，木夹子，显微镜等。

（四）实验步骤

1）制片：按常规涂片、干燥、固定。

2）染色：加数滴孔雀绿染液于片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持5min。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。

3）水洗：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。

4）复染：用番红染液复染2 min 。 5）水洗：用缓流水洗后，吸干。

6）镜检：干后油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。

（五）实验报告内容

绘图表示枯草芽孢杆菌的形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征。）

（六）思考题

1. 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？

2. 用Schaeffer-Fulton氏染色法加热染色时，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即补加染液？为什么？

3. 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？

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