2015初始污染菌实验方法验证(3)

YSLH-JS-004-01 培养基菌落数cfu 加入菌种 培养 胰酪大豆胨琼脂培条件 养基 33℃,48小时 23℃,72小时 培养基菌落数cfu 菌落形态大小于对照培养基上的菌落一致 结论 胰酪大豆胨琼脂对照培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨琼脂对照培养基 铜绿假单胞菌 平均值 金黄色葡萄球菌 平均值 枯草芽孢杆菌 平均值 白色念珠菌 平均值 黑曲霉 平均值 加入菌种 沙氏葡萄糖琼脂培养基/沙氏葡萄培养条件 沙氏葡萄糖琼脂培沙氏葡萄糖琼脂对照糖琼脂对照培养养基 培养基 基 23℃,72小时 结论 白色念珠菌 平均值 黑曲霉 平均值 菌落形态大小于对照培养基上的菌落一致 结论：从以上检测结果可知，上述批号的培养基适用性检查符合要求，可用于日常产品检测中的计数。 验证人/日期： 审核/日期：

3.5计数方法验证 3.5.1供试液的制备：

洗脱液用0.9%的灭菌生理盐水，检品液制备在10000级环境中进行。 3.5.2 接种和稀释

按下列要求进行供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。

（1）试验组 取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。

（2）供试品对照组 取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。

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（3）菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验。

3.5.3 抗菌活性的去除或灭活

供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%，可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。

⑴ 增加稀释液或培养基体积。 ⑵ 加入适宜的中和剂或灭活剂。 3.5.4 微生物的回收

按照6.2的计数培养基所用的试验菌逐一进行微生物回收试验，回收试验采用平皿法和薄膜过滤法。

3.5.4.1 平皿法--倾注法

取6个直径90mm 的无菌平皿。2个分别注入照上述“试验组”制备的供试液1ml； 2个分别注入照上述“供试品对照组”制备的供试液1ml；2个分别注入照上述“菌液对照组”制备的供试液1ml。每个平皿注入15～20ml 温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

3.5.4.2平皿法试验结果见表2

表2

冲洗一次 冲洗二次 冲洗三次 冲洗四次 回收率 平均回收率 修正系数 采用冲洗一次后*回收系数进行估算。 试验人/日期： 审核/日期 一次性包皮环切缝合器 一次性包皮环切缝合器 一次性包皮环切缝合器 样品1 26 0 0 0 100% 样品1 30 4 0 0 88.3% 93.7% 1.07 样品1 25 2 0 0 92.6% 结论：以上产品各做三套平均回收率达80%以上，一次回收率达到要求。正常试验中可

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3.5.4.3 薄膜过滤法

薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45μm,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

取照上述 “试验组”、“供试品对照组”和“菌液对照组”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml 或10cm2 的供试品, 若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中,混匀,过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。

若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。

3.5.4.4薄膜过滤法计数方法验证实验结果见表3 4.验证结论

从以上检测结果可知，上述培养基适用性检测符合规定，采用的薄膜过滤法计数方法符合规定，产品初始污染菌一次冲洗回收率符合规定，上述方法适用于产品的日常检测。

5.再验证周期

5.1当培养基批号改变时须对计数培养基进行适用性检查 5.2产品生产环境或原料发生改变时须进行计数方法的验证 5.3当检测环境发生改变时须重新验证

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表3

产品名称 实验组 一次性包皮环切缝合器 69 供试液+1ml大肠埃希菌 菌落回收率 供试液+1ml金黄色葡萄球菌 菌落回收率 供试液+1ml枯草芽孢杆菌 菌落回收率 供试液+1ml白色念珠菌 菌落回收率 供试液+1m黑曲霉 菌落回收率 细菌 供试品对照组菌落数 0 2 1 产品初始污染菌的检测。 实验人/日期 审核/日期

72 65 81.85 72 76 73 80.44 75 70 68 83.67 52 56 58 86.39 73 72 75 82.33 霉菌 1 0 0 / / / / 1ml黑曲霉 1ml白色念珠菌 1ml枯草芽孢杆菌 1ml金黄色葡萄球菌 1ml大肠埃希菌 菌液组 菌数 85 80 83 / 90 89 92 / 90 82 79 / 64 62 65 / 89 90 87 / / / / / 结论：由上表可知个供试品实验条件下各试验菌的回收率均＞70﹪，此试验计数方法有效，可用于

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