western blot注意事项

.1、 为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致？同样的电压可以吗？

解答：浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上（实际上也是）小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。

2、 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。 3、膜、滤纸、胶大小有何讲究？

解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。 结果分析：

2、 条带有时清晰，有时很散，不知为何？

解答：可能原因：样品可能存在降解；转膜不及时造成扩散；转移缓冲液甲醇浓度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％）。

3、背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡。

解答：这跟你washing的时间和强度有关，很可能你在这方面没有掌握好。显影时间是有范围的，久了肯定不行。

杂带多的原因无非是几点：

1、你的一抗如是多克隆抗体，可以试着降低一抗的浓度，如一抗是单抗，可适当降低二抗的浓度 2、还有最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少2小时室温封闭，时间允许可4度过夜封闭 3、就是洗膜一定要充分我们一般PBST 10分钟三次，还有看你是DAB 显色吧，背景过深，DAB显色时间不要过长，一般2分钟足够。

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