ND308抗脑缺血神经保护作用的研究(3)

　　1.4.6 测定脑组织中IL?1β、TNF?α、NF?κB的表达：制作好的石蜡切片常规脱蜡、水化，严格按照试剂盒说明书进行操作，DAB显色，酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。空白对照采用PBS代替一抗，胞浆内着棕黄色或褐色颗粒者为蛋白表达阳性细胞。免疫组化的照片分析：每只大鼠取皮层脑组织切片，在20倍物镜下，采用Image?proPlus 5.0软件计数阳性细胞光密度值(IOD值)，反映切片上阳性细胞组化染色的强弱。
　　1.5 统计学处理 所有数据用x±s表示，采用方差分析和组间两两比较t检验，P<0.05认为有显著性差异。
　　2 结果
　　2.1 ND?308对脑缺血再灌注大鼠神经行为障碍评分的影响 脑缺血再灌注模型组大鼠表现出明显的运动功能障碍，神经行为障碍评分增加，ND?308小剂量组亦可改善缺血大鼠运动功能障碍，但与模型组相比无统计学意义(P>0.05);ND?308大、中剂量组及阳性药依达拉奉可明显改善神经系统症状(P<0.05或P<0.01)，见表1。
　　2.2 ND?308对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响 ND?308大剂量组、中剂量组及依达拉奉组脑梗死体积明显低于缺血再灌注模型组(P<0.05或P<0.01)，见表1。表1 ND?308对脑缺血/再灌注大鼠行为障碍评分和脑梗死体积的影响
　　2.3 ND?308对脑缺血再灌注大鼠脑组织形态学的影响 假手术组大鼠缺血侧脑组织细胞排列整齐，细胞密度较大，胞浆丰富，HE染色着色较深，细胞核轮廓清晰，可见核仁、核膜，很少有坏死和凋亡细胞。模型组大鼠缺血侧脑组织变疏松细胞排列紊乱，细胞数明显减少，细胞间隙较大水肿引起的空泡化严重，胞浆着色较浅，可见大量凋亡和坏死细胞，表现为胞体皱缩，核固缩深染，核仁消失。ND?308治疗组及阳性对照依达拉奉组大鼠脑组织细胞排列较整齐，间质水肿程度明显减轻，细胞数明显增多，皮层细胞变性、坏死减少，多数存活细胞形态相对正常，病变减轻，各项病理改变均有不同程度的改善,见图1。
　　2.4 ND?308对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层组织炎症因子表达的影响 假手术组大鼠大脑皮层内没有或只有少量IL?1β、TNF?α、NF?κB表达，NF?κB主要集中在细胞浆内，缺血2 h再灌注24 h模型组大鼠大脑额顶叶皮质内IL?1β、TNF?α表达显著增加，NF?κB表达增多且向细胞核内移动，与假手术组相比有显著性差异(P<0.001)，ND?308小剂量组可减少缺血再灌注损伤后IL?1β、TNF?α表达，抑制NF?κB向细胞核内转运，但与模型组相比P>0.05，ND?308大、中剂量组及依达拉奉6 mg/kg组可明显减少上诉炎症因子表达(P<0.05或P<0.01)，见表2。表2 ND?308对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层组织
　　3 讨论
　　急性缺血性脑卒中的本质是脑血流障碍造成的脑损害，在治疗时间窗内早期恢复血流有利于缩小梗死范围、减轻神经损害。目前早期溶栓是治疗急性缺血性脑卒中最有效的措施，但由于溶栓时间窗的限制，事实上，所以能接受溶栓治疗的几率只有1%～2%[6]。同时，由于溶栓后再灌注引起的颅内出血、脑水肿等严重并发症也限制着溶栓治疗的推广应用。最近的研究表明，许多炎性介质和细胞因子介导的炎症反应在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用[7]。

　　TNF?α和IL?1β是公认的炎性介质，可以促进脑缺血损伤区粘附分子的表达和炎性细胞的浸润[8]。Liu等[9]研究发现中脑中动脉阻塞后1 h即有TNF?α mRNA的表达，3 h后缺血皮层中TNF?α mRNA表达上升，12 h达高峰。阻塞5 d后缺血皮层中TNF?α mRNA表达水平仍有明显的提高，在缺血皮层区的表达早在白细胞渗透之前出现，首次证明了在局部脑缺血造成的缺血性神经元中有TNF?αmRNA及蛋白的表达。Minami等[10]用Northern blot法显示IL?1βmRNA主要分布在海马回、下丘脑、皮质等。TNF?α过度表达，可加重神经功能损伤，扩大脑梗死范围，导致缺血脑组织血流量的减少，进一步加重血脑屏障的损害，促进脑缺血和水肿的发生发展，最终导致细胞坏死或凋亡[11，12]。脑缺血再灌注后，细胞受到损伤，各种神经胶质细胞、血管内皮细胞、神经元和血管周围的炎性细胞被激活，分泌大量的IL?1β，过多的、持续表达的IL?1β可以诱导粘附分子的表达，导致大量中性粒细胞在血管上粘附，释放有害的炎性介质，引起脑组织的损伤;同时IL?1β还可以激活内皮细胞产生多种活性物质，导致脑缺血程度加重[13，14]。

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