EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立(3)

    2.2  阳性克隆的筛选
    重组质粒转染PT67细胞后，加嘌呤霉素筛选抗性细胞克隆，每2 d换液1次，筛选至第5天出现大量细胞死亡，第8天时可观察到由数个细胞组成的阳性克隆，未转染重组质粒的对照细胞则几乎全部死亡。当细胞长至70％～80％汇合时，换半量不含嘌呤霉素的完全培养基，每24 h收取培养液上清为病毒原液。
    2.3  逆转录病毒滴度测定
    收集含有逆转录病毒的上清液感染NIH3T3细胞测定病毒滴度，得到逆转录病毒v?MSCV?2A的病毒滴度为3.2×107 CFU／L。
    2.4  重组逆转录病毒的RT?PCR鉴定
    提取PT67?LMP2A总RNA,RT?PCR产物琼脂糖电泳显示特异性1 500 bp预计大小的片段，表明重组腺病毒在293细胞能有效转录(图2)。

   3  讨    论
    EBV对宿主细胞的感染可分为潜伏感染和裂解感染两种类型，EBV相关肿瘤组织中病毒主要以潜伏感染的形式存在[1]。由于在EBV相关肿瘤组织中，EBV只感染癌细胞而不感染正常细胞，使得靶向基因治疗有可能通过EBV而实现。采用免疫学方法治疗EBV相关肿瘤是近年来倍受关注的焦点。应用EBV某种基因表达载体转染抗原提呈细胞(APC)如树突状细胞(DC)等，可以诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤EBV阳性肿瘤细胞起到抗肿瘤作用，目前此类研究仅局限于体外实验[2，3]。鉴于EBV在肿瘤组织中多以潜伏感染的形式存在，故EBV核抗原（EBNAs）和潜伏膜蛋白（LMP1和LMP2）基因是可以被采用的靶基因。在EBNA1分子中含有丰富的甘氨酸?丙氨酸重复序列，可以影响HLAⅠ类分子对其的处理和递呈；LMP1是重要的转化基因，其编码蛋白和EBV细胞转化功能密切相关，因此两者都不适于作为EBV相关肿瘤免疫治疗研究中治疗性疫苗的靶抗原。而其他EBNAs和LMP2均含有能被具有MHC限制性的病毒特异性CTL识别的抗原表位，能介导细胞毒性T细胞发挥作用，是较为理想的靶抗原[4，5]。LMP2A本身不是转化基因，但在EBV潜伏感染及转化细胞过程中发挥重要作用。在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中都能够检测出LMP2A，并且是鼻咽癌、淋巴瘤等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一，具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用。因此越来越多的研究表明，LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。
    基因治疗是将外源基因插入合适的表达载体，再以重组载体转染靶细胞，使目的基因在靶细胞或体内高效表达，从而达到治疗目的。基因治疗的重要策略之一是要选择稳定、有效而又安全的表达载体，逆转录病毒载体是第一个被改造用于人类基因治疗研究的病毒载体，也是目前为止人类基因治疗运用最广泛的载体,具有转移效率高、表达稳定等优点。据报道人类基因治疗方案中有一半以上是用逆转录病毒载体转染成功的包装细胞系，通过把目的基因重组到逆转录病毒载体，再将重组表达载体导入包装细胞系中，进行复制、表达和装配而形成假病毒颗粒，这是目前基因治疗实验研究和临床试用中广泛采用的载体系统[6]。
    LMP2A可以诱导CTL杀伤EBV阳性肿瘤细胞起到抗肿瘤作用，但近年来的研究表明，它本身是一种抗凋亡基因，并且能促进EBV感染。CHEN等[7]研究显示，LMP2A能够通过MAPK激酶影响c?Jun蛋白的磷酸化和稳定性，并能提高细胞的运动能力，以促进EBV感染细胞的迁徙和恶性肿瘤细胞的转移过程；ENGELS等[8]利用新型的鼠模型证明， LMP2A通过选择性活化或抑制SLP?65调节的信号途径，致使EBV潜伏感染；PORTIS等[9]对非转基因鼠和LMP2A Tg6转基因鼠BCR活化的B细胞基因转录物进行了比较研究，发现LMP2A可能通过直接或间接改变基因转录抑制BCR信号转导，促进EBV在B细胞中的持续感染。

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