高效液相色谱法同时测定清新灵微丸中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量(2)

　　色谱柱为Diamonsil ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱，流动相为甲醇∶水=54∶46(磷酸调pH2.5)，流速1.0 ml·min-1，检测波长为263 nm，柱温为25℃。进样量为10 μl，理论板数按盐酸小檗碱和黄芩苷计算均不低于4 000，分离度均不低于1.5。

　　2.2 溶液的制备

　　2.2.1 对照品溶液的制备

　　精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每毫升含盐酸小檗碱500 μg的溶液，作为储备液A。精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含625 μg 黄芩苷的溶液，作为储备液B。分别精密量取对照品储备液A 5 ml和对照品储备液B 10 ml置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成混合对照品储备液(含盐酸小檗碱100 μg·ml-1和含黄芩苷250 μg·ml-1)，备用。

　　2.2.2 样品溶液的制备

　　精密称定自制清新灵微丸0.025 g,置100 ml容量瓶中,加适量甲醇，超声20 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，备用。

　　2.2.3 阴性样品溶液的制备

　　按清新灵微丸的组成处方及工艺分别制成不含盐酸小檗碱和黄芩苷的阴性样品,按“2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。测得对照品、样品、阴性样品色谱图见图1。

　　2.3  线性关系考察

　　分别精密吸取混合对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml置10 ml容量瓶中,加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系列标准溶液。分别进样10 μl，以对照品浓度C(μg·ml-1)为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标进行线性回归，得盐酸小檗碱、黄芩苷的回归方程分别为：Y=9 669.7X+16 831(r=0.999 2)；Y=10 520X+36 941(r=0.999 1)。结果表明：盐酸小檗碱在 10.0～60.0 μg·ml-1范围内线性关系良好；黄芩苷在25.0～150.0 μg·ml-1范围内线性关系良好。

　　2.4  精密度实验取“2.2.2”项下对照品溶液4.0 ml置10 ml容量瓶中,加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。按上述色谱条件测定，连续进样5次，测得盐酸小檗碱的峰面积RSD为0.6 %、黄芩苷的峰面积RSD为0.8 %。

　　2.5  精密度实验取“2.2.2”项下对照品溶液4.0 ml置10 ml容量瓶中,加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。按上述色谱条件测定，连续进样5次，测得盐酸小檗碱的峰面积RSD为0.6 %、黄芩苷的峰面积RSD为0.8 %。

　　2.6  稳定性实验取同一样品溶液,按上述色谱条件于0，2，4，8，12，24 h进样测定峰面积，RSD为0.8 %和1.0 %。结果表明盐酸小檗碱、黄芩苷在24 h内稳定。

　　2.7  回收率实验采用加样回收率法,分别取已知含量的同一批样品9份，每份0.025 g,精密称定，按含量的80 %，100 %，120 %分别加入一定量的盐酸小檗碱、黄芩苷对照品溶液，然后按“2.2.2”项下方法制备供试液，在上述色谱条件下测定盐酸小檗碱、黄芩苷含量。回收率实验结果见表1～2。表1  盐酸小檗碱回收率实验结果（略）表2  黄芩苷回收率实验结果（略）

　　2.8  样品含量测定取3批样品,在上述色谱条件下每批测定5次，计算出黄芩苷、盐酸小檗碱的含量。结果见表3。表3  样品测定结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  检测波长的选择在200～400 nm波长范围内进行扫描，盐酸小檗碱对照品溶液在263，345 nm波长处有最大吸收，黄芩苷对照品溶液在277，317 nm波长处有最大吸收。参考有关文献［2］，277，270，263 nm波长处色谱图进行比较，分别计算两种组分含量，结果表明：盐酸小檗碱在3个波长处的含量变化不大，而黄芩苷的含量变化较大，为使两个峰面积大小相近，选择263 nm作为检测波长较为合理。

　　3.2  流动相的选择预试验中采用①乙腈-0.02 mol/L磷酸=50∶50［4］；乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)=50∶50［4］；乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾=50∶50［5］；乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾=50∶50(每1 000 ml中加入十二烷基硫酸钠1.7 g)［6］，乙腈-甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾=40∶10∶50［7］。结果表明：未加磷酸二氢钾的流动相小檗碱出峰时间过早，加磷酸二氢钾可以调整并延长盐酸小檗碱保留时间，适量加入十二烷基硫酸钠可防止盐酸小檗碱拖尾，但目标成分黄芩苷保留时间过短，在较低强度的乙腈流动相中就比较容易洗脱，无法与溶剂峰分开，故无法采用乙腈流动相系统。②甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾=50:50［3］；甲醇∶水=50∶50；甲醇∶水=55∶45［8］；甲醇∶水=54∶46(磷酸调pH 2.5)。结果表明，甲醇系统可避免溶剂峰的干扰，但甲醇-水系统无法使盐酸小檗碱和黄芩苷色谱峰分开，加入磷酸二氢钾后盐酸小檗碱拖尾，且黄芩苷和盐酸小檗碱保留时间差异较大，无实际应用价值。经预试验进行各种比例试验后，确定甲醇∶水=54∶46(磷酸调整pH至2.5)时，可避免溶剂峰的干扰，盐酸小檗碱和黄芩苷色谱峰分离良好，且均不拖尾。

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